熒光分析法測定維生素B2

一、實驗目的
1．學習和掌握熒光光度分析法測定維生素B2的基本原理和方法； 2．熟悉熒光分光光度計的結構及使用方法； 3.  學習掌握固體及液體試樣的熒光測試方法。
二、實驗原理
當用一種波長的光照射某種物質時，這種物質會在極短的時間內，發射出一種比照射光波長較長的光，這種發射出來的光就叫做熒光。當照射光停止照射時，熒光也隨之很快地消失。利用某些物質被紫外光照射后所產生的、能夠反映出該物質特性的熒光，以進行該物質的定性分析和定量分析，稱為熒光分析。
實驗證明，熒光通常發生于具有剛性平面的л-電子共軛體系分子中。隨著л-電子共軛度和分子平面度的增大，熒光也就越容易產生。因此幾乎所有對分析化學有用的熒光體系都含有一個以上的芳香基團，芳環數越多，熒光愈強。能發熒光的純無機物很少，通常是利用有機配位體與金屬離子形成熒光絡合物進行無機離子的分析。

圖1．熒光分光光度計的結構原理圖

熒光分光光度計工作原理（圖 1）可簡述為：光源發出的光束經激發單色器色散，提取所需波長單色光照射于樣品上，由樣品發出的熒光經發射單色器色散后照射于檢測器上，檢測器把熒光強度信號轉變為電信號并經放大器放大后，由信號顯示系統顯示或者記錄。
熒光光譜包括激發光譜和發射光譜兩種。激發光譜是是指發射單色器波長固定，而激發單色器進行波長掃描所得到的熒光強度隨激發光波長變化的曲線。熒光發射光譜是指激發單色器波長固定，發射單色器進行波長掃描所得到的熒光強度隨發射光波長變化的曲線。一般所說的熒光光譜實際上僅指熒光發射光譜。這一光譜為分析指出了最佳的發射波長。
熒光定性定量分析與紫外可見吸收光譜法相似。定性時，是將實驗測得樣品的熒光激發光譜和熒光發射光譜與標準熒光光譜圖進行比較來鑒定樣品成分，一般熒光定性的依據是熒光光譜峰的個數、位置、相對強度及輪廓。
定量分析時，一般以激發光譜最大峰值波長為激發光波長，以熒光發射光譜最大峰值波長為發射波長，測量樣品的熒光強度。對同一物質而言，熒光強度F與該物質的濃度c有以下的關系：
F=2.303Ф_fI₀abc          ⑴
Ф_f－熒光過程的量子效率； a－熒光分子的吸收系數；
I₀－入射光強度；  b－試液的吸收光程。
在I₀和b 不變時，2.303Ф_fI₀ab為常數，則⑴式可以表示為
F＝Kc                     ⑵
⑵ 即可作為熒光定量檢測的依據。

圖2 VB2的結構式

如圖2 所示，VB2具有一個芳香環結構及л-電子共軛體系，在430 nm～460 nm 藍光的照射下，發出綠色熒光，其峰值波長為527 nm。VB2的熒光在pH=6～7 時最強，在pH=11 時消失。
三、儀器與試劑
1．儀器：Cary Eclipse 熒光分光光度計(原美國瓦里安公司,現美國安捷倫公司)。 2．試劑：
（1）VB2 標準溶液（10.0 mg/L：準確稱取10.0 mg VB2，將其溶解于少量的1% HAc中，轉移至1 L 容量瓶中，用1% HAc 稀釋至刻度，搖勻。轉移至棕色試劑瓶中，置陰涼處保存。
（2）待測液：取市售VB2一片，用1% HAc 溶液溶解，定容到1000mL，貯于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存。
四、實驗步驟 1. 液體樣品測試
1.1. 標準系列溶液的配制
取五個干凈的25 mL 容量瓶，分別加入1.00、2.00、3.00、4.00 和5.00 mL VB2 標準溶液，再分別加入 4.00、3.00、2.00、1.00及0.00 mL 1%的醋酸，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。 1.2．VB2發射光譜的制作
將激發單色器固定為449 nm，發射單色器在470-800 nm范圍內進行波長掃描，分別制作五個標準樣品的熒光發射光譜。 1.3．標準曲線的制作
以VB2標準溶液的濃度為橫坐標，相應發射光譜的峰值熒光強度為縱坐標，繪制用于VB2定量檢測的標準曲線并得出相應的標準線方程。 1.4．未知試樣的測定
取待測液2.50 mL 置于25 mL 容量瓶中，加入2.50mL 1%的醋酸，用H2O 稀釋至刻度，搖勻。用測定標準系列時相同的條件，測量其熒光強度。將測定的熒光強度代入標準曲線方程，計算出未知試樣中VB2的濃度。
2. 固體樣品測試
2.1. 制樣 
取適量VB2樣品，置于樣品池石英片上，旋緊樣品池的螺絲，使VB2粉末在
石英片上平鋪一層，再將樣品池置于固體樣品架上。 2.2. 固體VB2熒光發射光譜的制作 
用與液體樣品測試相同的參數設置，進行VB2固體熒光發射光譜的測試。
五、思考題
1．熒光測定時，為什么激發光的入射與熒光的接收不在同一直線上，而成一定角度？
2．改變激發波長，熒光發射光譜會有何變化？為什么？