蛋白質鑒定

　　用MS鑒定蛋白質的多數方法中，或經過1D或2D膠分離或不經分離直接鑒定，首先都需要蛋白水解酶的酶解，最常用的酶是胰蛋白酶，它是一種序列特異性的蛋白酶，只切割精氨酸或賴氨酸殘基的C端。從膠上切下用于酶解的體積盡可能小的膠帶，隨后再將膠切成約1mm3的小塊放于小離心管中。下面的步驟是根據Wilm等人發表的方法而來的。用100mM碳酸氫氨(一個2D膠斑點~50ul)洗膠塊5min，之后除去緩沖溶液，加50ul乙腈并使膠脫水10-15min。如果膠塊沒有完全脫水就需要再換一次乙腈，最后傾出乙腈，在Speed-Vac 中完全干燥(在低溫狀態~15min),用50ul含有10mMDTT的100mM碳酸氫氨溶液(新鮮配置)再水化膠,在56℃下加熱30min還原樣品，之后傾出DTT溶液，加乙腈于膠中15min后在Speed –Vac 中干燥(低溫 15min)，加50ul含有55mM碘乙酰胺的100mM碳酸氫氨溶液烷基化半胱氨酸殘基，避光在室溫下放置20min，棄去上清液用100mM的碳酸氫胺緩沖液沖洗，然后換用新的碳酸氫胺緩沖液洗15min,如果這一步還不能完全脫色，需用100mM碳酸氫氨：乙腈1:1的溶液在37℃振搖 30min，重復此步驟直到完全脫色。傾出液體加入50ul的乙腈約15min后，在Speed-ac 中干燥,再在50mM包含測序級胰酶的碳酸氫氨溶液中再水化。酶的儲存液是在25ug的胰酶中加250ul的0.1%三氟乙酸。每份(15ul)被儲存在 4℃下。活性酶溶液的制備是每份15ul加100ul的50mM碳酸氫胺溶液,終濃度是13ng/ul.。加入約20ul的胰酶溶液于膠塊中(充分再水化后的膠塊)并放置在4℃下再水化45-60min，移走過量的胰酶溶液加入少量的 50mM的碳酸氫胺溶液(10-20ul)使膠塊在酶解過程中保持浸潤，在37℃孵育1小時，然后在室溫下過夜。

　　下一步樣品處理是根據不同質譜鑒定方法來決定，主要有三種鑒定技術按照被鑒定蛋白難易度而依次應用. MALDI-TOF是一種最有效的鑒定技術,它可通過肽指紋圖譜(PMF)來鑒定蛋白質。用這種技術檢測胰酶酶切后的肽質量數有很高的準確度(達到 100ppM或更高),可與理論上預測的胰酶對蛋白酶切后所形成的一系列肽質量數比較(數據庫查詢)。由于大多數肽段只帶一個電荷，在譜中以單峰的形式存在，因此MALDI-TOF MS數據很容易解釋。對于基因組序列已完全確定了的生物體如Saccharomyces cerevisiae 和Caenorhabditis elegans，這種技術尤其有用，因為所有被胰酶酶切后生成的多肽質量數可以用一個封閉的數據包準確預測。MALDI-TOF(帶反射功能)能夠通過源后延遲PSD功能獲得肽序列信息，然而這種技術要求樣品的初始量至少達pmol，且質譜圖不如傳統的MS/MS 好解釋。MALDI-TOF，與其它下面將討論的技術不同，分析蛋白混合物和確定混合物中所有單個組分的能力較差。盡管如此，但是通過反復搜尋仍經常可從 MALDI-TOF數據中鑒定出2~3個蛋白質。作為應用MALDI-TOF的一個例子，在下面介紹用該方法鑒定酵母中p24蛋白。分析蛋白酶解物，是根據Jensen 等(14)改良的方法。在該方法中，先將5%甲酸點到預先涂好基質的不銹鋼靶上，然后將與甲酸等體積的酶解上清液直接加樣于靶上進行測定。該方法用于微量多肽更為靈敏，但不適合源后裂解，因為靶的表面樣品含量很快就會削減.

　　新鮮配制10mg/ml的a -氰基-4-羥基肉桂酸于丙酮/2-丙醇(1:1v/v)中，以 4:1的比例和硝酸纖維素[10mg/ml在丙酮/2-丙醇(1:1v/v)]混合。點約0.3m l 基質混合液于靶上，需將基質經蒸發保持成薄層(膜)。很小心地加0.3m l 5%甲酸于靶上，然后再直接加0.5m l樣品。讓靶自然干燥。用5%甲酸洗靶(~1m l/靶)。用高壓氣體吹干過量的洗液，最后將靶裝入質譜儀。

　　如得不到完整的序列信息，或當MALDI-TOF 分析不能確定時，需要采用電噴霧電離串聯質譜(ESI-MS/MS)來獲得確定的序列信息以用于數據庫的檢索，或用于克隆實驗。當應用MS/MS分析時，首先選擇要測序的肽離子再由碰撞誘導解離(CID)得到其碎片離子，由CID得到的肽的碎片離子可以從圖1得到很好的說明。如果采用ESI-MS時，胰酶酶解的肽通常得到的是雙電荷分子離子，這是因為分子的每一個末端都是最可能的質子化位點，任何骨架鍵的斷裂均可產生兩個單電荷序列離子碎片，由骨架鍵斷裂產生的離子如果電荷在N末端,碎片被定義為a，b，c，如果電荷在C-末端被定義為x，y，z, 通常在低能量裂解情況下，不產生c和z離子，a離子是b離子失去CO(28Da)得到的。骨架鍵斷裂還可能得到immonium離子和acylium離子。Acylium離子是由兩個骨架鍵斷裂后形成的。離子m/z值高于母離子的通常為y離子系列，在許多情況下, 從y離子系列可以得到部分序列信息，這些信息是數據庫檢索的基礎。

　　納升電噴霧(納升流速的ESI)是基于Wilm和 Mann的理論研究，現在已經發展成為分析從1D和2D上分離得到的微量蛋白質的有利工具。蛋白質在膠上酶解后得到的酶切肽段樣品1ul，經被拉伸成超微孔點的玻璃或石英針孔噴霧而出，一微升可以噴1小時或更長的時間，這樣，在溫和能量碰撞下可重復進行許多次MS/MS實驗。與快速數據庫檢索相聯，可進行實時蛋白質鑒定。在同次噴霧中，還可進行進一步的確認實驗，或對復雜混合物組分深入研究，另外，通常在三級四級桿質譜儀器中，這種方法可以通過母離子掃描來分析翻譯后修飾如糖基化。最初磷酸肽和糖肽是基于從CID得到的特殊信號離子來鑒定的。所有的肽離子都有序地進入碰撞室，但是質譜所記錄的是那些產生感興趣的信號離子的母離子。舉個例子，選擇作為子離子(PO3-)的m/z79作為磷酸肽的指示物，它們的母離子被裂解以確定磷酸化位點。納米串聯質譜是相當靈敏并在鑒定生物學重要復合物時發揮著關鍵的作用。納米噴霧接口可用在許多商業電噴霧質譜儀中。專用細針可通過已商業化設備(puller)牽拉而成 (Sutter Instruments Novato,CA,USA)或購自現成產品(Protana A/S; New Objective Inc.,Cambridge,MA;Micromass,Manchester,UK)。

　　樣品上樣進行質譜分析的另一個方法是用在線LC-MS/MS，即在電噴霧接口前采用HPLC分離多肽。當多肽從色譜柱中流出時,質譜(Q- TOF,Micromass,Manchester,UK)自動選擇母離子進行MS/MS分析。為了保證靈敏度,75到180um大小的柱子采用低流速。這個系統比大孔徑柱難于維護,但是一旦得到一個穩定的配置，他們將顯示非常強大的功能. 在線方法有幾個優點, 包括高靈敏度、在線脫鹽和自動化等。當然每運行一次產生的幾百個MS/MS圖譜是相當大的文件(超過1Gb)，但是相應軟件的出現使得預先不需對數據做任何說明就可以對完整的運行過程進行自動分析, 而且數據庫檢索的速度已不成問題，能夠在幾分鐘內就得出所有檢索的結果.

　　納米電噴霧和在線LC-MS/MS兩種方法是相互補充的，各有優勢。例如，納米電噴霧更適于全新序列的分析(de novo sequencing)，可以對非常復雜的混合物進行蛋白序列分析，而在線LC-MS/MS幾乎可以達到無人操作的自動化程度(unattended operation)。許多測序實驗室同時使用這兩種方法。在下面我們將介紹因樣品不同而采用不同技術的策略.