論文解讀：大腦中的哪些神經回路與獎賞和厭惡刺激有關

　　美國斯坦福大學的研究人員用一種巧妙方法鑒定出大腦中與獎賞和厭惡刺激相關的神經回路。這項在小鼠中開展的研究可能對于解決人類的多種精神疾病，包括焦慮癥、失眠和抑郁及其他神經失調性疾病具有極為重要的啟迪意義。

　　這篇題為“Parallel circuits from the bed nuclei of stria terminalis to the lateral hypothalamus drive opposing emotional states”的論文發表在《Nature Neuroscience》雜志8月刊上。第一作者為斯坦福大學的William Giardino。

實驗背景

　　對厭惡或獎賞刺激做出適當的反應，以便快速響應環境的變化，這對生存而言至關重要。用于調節情緒的皮質下神經系統在進化上的保守性也提示其對于生存的重要意義。

　　趨近和回避行為的背后機制到底是什么？該研究聚焦于負責調節激勵情感因素的下丘腦外側區（LH）的復雜連結。外側下丘腦神經元由多種不同類型細胞混合組成，而后核LH神經元表達一種神經肽——下丘腦泌素（HCRT；也被稱為食欲素/orexin）——這種下丘腦泌素HCRT對動機性行為尤其重要。HCRT-LH神經元可接收來自大腦回路的信號，通過HCRT受體信號通路實現行為狀態的轉變，被認為可促進消極的和積極的兩種情緒狀態。但要分析HCRT-LH神經元活性和情緒性行為之間的精確機制，依然困難重重。

　　我們知道大腦杏仁核區對于恐懼、獎勵和焦慮等情緒處理來說是至關重要的大腦區域。

　　杏仁核外延的終紋床核（BNST）是連接杏仁核與下丘腦的區域。在這項新研究中，研究人員證實了下丘腦外側區LH神經元的輸入（input）正是源自于終紋床核（BNST）的密集突觸輸入，可能由此控制響應情緒刺激產生的復雜行為反應，并且鑒別了終紋床核（BNST）和外側下丘腦（LH）之間的、與趨近/回避行為相關的兩組不重疊的神經通路。

實驗看點

　　本文設計了一系列巧妙的實驗方案，得以在活體小鼠中精確解析終紋床核（BNST）到外側下丘腦（LH）之間的腦回路，值得參考。

　　1. 構建模式小鼠。神經系統的功能研究需要在活體進行，構建模式小鼠使得研究人員能夠觀察遺傳定義下的可自由移動的活體小鼠在特定刺激下的響應與行為，從多個角度不同方位進行實驗分析驗證。

　　研究人員委托賽業生物（Cyagen）制備了Hcrt-IRES-Cre小鼠，這是一種Cre重組酶特異性表達小鼠，在有下丘腦泌素Hcrt基因表達的組織/細胞就有Cre重組酶的表達，在外側下丘腦LH內部給予Cre誘導型熒光標記的腺相關病毒（AAV），>90%表達病毒的神經元是HCRT+，表明該模式小鼠Hcrt-LH區域具有特異性重組酶活性。

　　2. 不同的外界信號刺激會對LH神經元產生什么影響？

　　以基于用GCaMP6（基于綠色熒光蛋白GFP作為 Ca2+的指示劑）轉染小鼠體內Hcrt-LH神經元，在外側下丘腦LH上方植入光纖，以此來記錄監測在不同（厭惡或獎賞）刺激條件下內源性鈣信號（Ca2+）的變化。將植入小鼠安置在可進行自由移動實驗的環境中。

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  實驗表明：相對于無刺激的本底信號，環境中給予任何一種刺激——即使是無味的生理鹽水——也會引起Hcrt-LH Ca2+活性升高，熒光活性提高。相比對照刺激，給予捕食者氣味（三甲基-3-噻唑啉（狐貍尿））刺激時Hcrt-LH GCaMP6 熒光活性顯著升高。數據分析表明這些神經元對負面情緒的刺激特別敏感。

　　用同上的方法分析表達瘦素受體標記的LepRb-LH（leptin receptor）神經元 (LepRb-Cre)。LepRb-LH神經元與前面的Hcrt-LH神經元并不重疊，先前研究已知LepRb-LH神經元可通過Hcrt-LH神經元的GABA能抑制（GABAergic inhibition）來調節神經內分泌和應激反應行為。

　　植入光纖監測 GCaMP6+ LepRb-LH 神經元結果顯示，所有刺激均降低熒光信號，特別是捕食者氣味明顯降低LepRb-LH神經元的 Ca2+活性，與前面的Hcrt-LH神經元截然不同。

　　3. Hcrt-LH在獎賞和厭惡刺激下都會激活，這個說法是真的嗎？生理刺激LepRb-LH神經元和Hcrt-LH神經元會有怎樣的結果？

　　繼續重復上述的實驗設計思路：用增強的黃色熒光蛋白標記的光敏通道蛋白（ChR2-eYFP；或僅eYFP對照病毒）轉染小鼠體內Hcrt-LH神經元，結果>90%的ChR2-eYFP+細胞為表達HCRT+ 細胞。在小鼠LH上方植入光纖并給予不同光刺激（將植入小鼠安置在可進行自由移動實驗的環境中），觀察小鼠在實時位置趨向實驗 (the real-time place test，RTPT)中的行為偏向。

　　結果表明，相比對照組，Hcrt-LH-ChR2 小鼠回避光刺激（縮短在光刺激側的停留時間，而進入次數沒有變化/提示與位置無關）提示光刺激使Hcrt-LH神經元產生了厭惡、消極的情緒狀態。用Hcrt受體拮抗劑可阻斷這一趨避行為。而KOR阻斷劑不能改變趨避行為。

　　相反的，光刺激LepRb-LH-ChR2小鼠則表現為趨近偏好（延長停留在光刺激側時間，而進入次數沒有變化/與位置無關）表明LepRb-LH神經元激活是趨近偏好的。這兩組神經元在刺激誘導下表現出各自獨特的Ca2+離子活性特征，產生了效價效應相反的趨近和回避行為。

　　4. 接著來，證實LH輸入源為BNST。杏仁核外延的終紋床核（BNST）是連接杏仁核與下丘腦的區域。

　　為了探索Hcrt-LH神經元負面情緒狀態的神經回路，作者又想了個辦法嘗試找出驅動調控Hcrt-LH神經元的上游網絡。用糖蛋白缺失的狂犬病病毒（RVdG-GFP）單突觸追蹤策略，全腦分析確定了來自前腦，下丘腦，杏仁核，中腦和腦干的主要傳入輸入，最后定量分析顯示終紋床核BNST是Hcrt-LH神經元主要輸入源（除LH來源外的），也是LepRb-LH神經元的主要輸入來源。與LebRb-LH相比，Hcrt-LH神經元從LH本身接收輸入較少，來自室旁下丘腦（PVN）和腹側被蓋區域（VTA）的輸入較多。這些數據表明多種LH細胞類型共享一個主要輸入源終紋床核（BNST），但也從其他來源接收差異豐富的輸入。

　　5. 再接著溯源，具體是BNST的哪一部分負責輸入信號給這兩組LH神經元？

　　作者又鑒定出與Hcrt-LH神經元直接突觸接觸的BNST神經元。通過切片分析LepRb-Cre小鼠和Hcrt-Cre小鼠中的RVdG-GFP +細胞集中于BNST的不同區域，Hcrt-Cre更集中于側向BNST。選擇Crf（促腎上腺皮質激素釋放因子）作為側向BNST標記（Crf-BNST神經元可調節焦慮，恐懼和成癮相關行為）。Cck（膽囊收縮素）作為內側BNST神經元標記。Hcrt-LH小鼠中的RVdG-GFP + BNST神經元包含更多的Crf-BNST群體（相比Cck-BNST）,Hcrt-LH神經元從Crf +神經元接受更多輸入（約60％的Hcrt-LH神經元接受來自Crf-BNST神經元的直接輸入，而只有約12.5％的Hcrt-LH神經元接受來自Cck-BNST神經元的直接輸入）。

　　6. 那么Crf+ BNST 神經元和Cck+ BNST 神經元的生理學和行為學表現會有什么不一樣呢？

　　構建Crf-Cre和Cck-Cre小鼠繼續上述設計來鑒別BNST-LH的神經回路。在Crf-Cre和Cck-Cre小鼠的BNST中表達ChR2-eYFP（或僅eYFP），并在LH上植入光纖。Crf-BNST-ChR2光刺激產生了對刺激側的逃避，表明Crf-BNST激活是厭惡性的（回避）。 Cck-BNST-ChR2光刺激產生了對刺激配對側的偏好，表明Cck-BNST激活是獎勵性的（趨近）。BNST→LH光刺激的 實時位置趨向實驗（RTPT）顯示Crf-BNST→LH-ChR2小鼠的回避行為；光刺激Cck-BNST→LH-ChR2小鼠產生偏好/趨近行為，表明遺傳定義的BNST→LH途徑可產生相反的情緒狀態。同樣的，Crf-BNST -GCaMP6 熒光活性在捕食者氣味刺激下（有害）顯著升高（相對其他刺激），而Cck-BNST -GCaMP6熒光活性則在雌性小鼠尿刺激下（有利）顯著升高，阻斷Cck（而不是Crf）能降低這種趨向。通過實驗作者還證實了這兩類神經元不重疊。

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　　實驗結果：確定了兩個空間隔離的GABA能BNST亞群，它們（i）表達不同的神經肽標志物，（ii）差異支配所定義的LH亞群，（iii）表現出不同形式的顯著刺激誘導Ca2+活性，（iv）接收來自不同上游網絡的傳入輸入，以及（v）驅動相反的趨近和回避行為。

　　研究人員認為，這些數據提供了一個先進的模型，說明平行的終紋床核至外側下丘腦回路如何通過特定的神經元亞群來推動不同的情緒狀態。這種實驗模型為難以研究的神經回路提供了一種值得參考的設計。這項研究有望為精神疾病中LH回路失調提供思路，未來的研究將為開發改進的治療方法提供信息。