質粒載體和外源DNA的連接反應

實驗概要

掌握DNA體外連接的基本技能，了解連接反應的注意事項。

實驗原理

DNA片段之間的連接是通過DNA連接酶的催化實現的。DNA連接酶催化具有平末端或互補粘性末端的DNA片段間相鄰堿基通過3’,5’磷酸二酯鍵連接起來，該反為需能反應，通常需要加入ATP或NADH，DNA連接酶對粘性末端的連接效率要遠高于對平末端的連接效率。在基因基因工程實驗中，最常用的來源于T4噬菌體的T4DNA連接酶。對于平末端或互補的粘性末端可直接進行連接反應。一個片段是平末端，另一片段為粘性末端或兩個片段都是粘性末端但不配對，則需要通過各種方式使其可一匹配或通過平末端進行連接。通常采用末端補平、加同聚物尾、加接頭等方式是目的片段之間能夠匹配。
 

進行連接反應時，為了減少片段的自連，通常要進行去磷酸化，去磷酸化可通過堿性磷酸酶完成。比如將目的片段和載體進行時通常要將載體去磷酸化，以減少載體的自連。同要進行連接反應也經常對目的片段進行磷酸化以增強目的片段的連接，在相鄰堿基間如果沒有磷酸在連接效率大幅下將，如果載體進行了去磷酸化，目的片段可進行磷酸化，以增強目的片段和載體的連接。
 

在連接反應中，目的DNA片段和載體的比例是一個關鍵問題，對于長度為1kb的片段和3kb的載體而言，通常目的片段和載體的比例設為2：1或3：1，如果目的片段越長該比例應再升高，因為主要考慮的是載體和目的片段之間的分子數的比例。反應體系中核酸的濃度也是一個重要問題，通常反應體系中反應物濃度應保持在25-100 ng / μl。
 

連接反應和其它酶不同，需要在較低的溫度下進行，通常在12～16℃過夜，也可在4℃過夜連接，如果是平末端連接，可適當提高連接溫度。除上述因素外，DNA樣品的純度、鹽濃度等會影響連接效率。

主要試劑

1、目標DNA片段（實驗九RT-PCR擴增產物）

2、載體（pGEMT-easy）

3、2 × ligation 緩沖液

4、T4 DNA連接酶

5、ddH2O

主要設備

1、臺式離心機

2、恒溫水浴

3、微量移液器

實驗步驟

1、取一個1.5ml離心管依次加入下列試劑:
 

2 × buffer：               5μl

pGEMT-easy：    0.5μl

目的片段：               2.5μl

T4連接酶：                1μl

ddH2O                       1μl

2、2000 rpm 離心30S，使反應體系充分混合。

3、4℃過夜連接。