轉氨酶活性的測定

實驗概要

本實驗介紹了轉氨酶活性測定的原理及方法等。

實驗原理

轉氨酶是體內重要的一類酶。轉氨酶催化α–氨基酸的α–氨基與α–酮酸的α–酮基之間的相互轉化，從而生成一種新的氨基酸與一種新的酮酸，這種作用稱為轉氨基作用。它在生物體內蛋白質的合成、分解等中間代謝過程中，在糖、脂及蛋白質三大物質代謝的相互聯系、相互制約及相互轉變上都起著很重要的作用。

在動物機體中活力最強、分布最廣的轉氨酶有兩種：一種為谷氨酸丙酮酸轉氨酶（簡稱GPT），另一種為谷氨酸草酰乙酸轉氨酶（簡稱GOT）。它們的催化反應如下：

GOT催化生成的草酰乙酸在檸檬酸苯胺的作用下轉變為丙酮酸與二氧化碳。由上可見此反應最終產物都是丙酮酸。測定單位時間內丙酮酸的產量即可得知轉氨酶的活性。

丙酮酸可與2,4 – 二硝基苯肼反應，形成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色。再與同樣處理的丙酮酸標準液進行比色，計算出其含量，以此測定轉氨酶的活性。

丙酮酸   2,4 – 二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙（棕紅色）

轉氨酶的活性單位為：每毫升血清與基質在37℃下作用60min，生成1μmol丙酮酸為1個單位。

主要試劑

1．磷酸鹽緩沖液（pH7.4）：

甲液：1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）9.47g（或Na₂HPO₄·12H₂O 23.87g）溶于蒸餾水，定容至1 000 ml。

乙液：1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液：稱取磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）9.078g，溶于蒸餾水，定容至1 000 ml。

取甲液825 ml，乙液175 ml，混合，測其pH為7.4即可使用。

2．GPT基質液：稱取a  – 酮戊二酸29.2 mg及DL – 丙氨酸1.78g，溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液20ml 中，溶解后再加緩沖液70ml,  并移入100ml容量瓶內。加1mol/L的NaOH溶液0.5ml，校正pH至7.4。再以pH7.4的磷酸緩沖液定容至100ml。貯存于冰箱備用，可用1周。

3．GOT基質液：稱取a  – 酮戊二酸29.2 mg及DL – 天冬氨酸2.66g，溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液20ml 中，溶解后再加緩沖液70ml,  并移入100ml容量瓶內。加1mol/L的NaOH溶液0.5ml，校正pH至7.4。再以pH7.4的磷酸緩沖液定容至100ml。貯存于冰箱備用，可用1周。

4. 2,4 – 二硝基苯肼溶液：稱取2,4 – 二硝基苯肼20mg，先溶于10ml濃鹽酸中（可加熱助溶），再以蒸餾水稀釋至100ml（有沉渣可過濾），棕色瓶內保存。

5．丙酮酸標準液（1ml=2μmol丙酮酸）：精確稱取丙酮酸鈉22mg，溶解后轉入100ml容量瓶中，用磷酸緩沖液（1/15 mol/L，pH7.4）稀釋至刻度。

6．0.4 mol/L氫氧化鈉溶液。

7．血清

8．檸檬酸苯胺溶液：取檸檬酸50克溶于50ml蒸餾水中，再加苯胺50ml充分混合即成，低溫出現結晶時，可置于37℃水浴中，待溶解后應用。

實驗步驟

1．標準曲線制作：取6支試管按下表操作。

水浴37℃，10min

水浴37℃，20min

混勻后，在520nm波長處，以空白調“0”點，讀取各管光密度。以單位值為橫座標，光密度為縱座標，繪制標準曲線。

2．G PT（GOT）測定：取2支潔凈的試管按下表操作。

混勻, 37℃水浴，60min

混勻, 37℃水浴，20min

混勻，放置5min，在波長520nm處測定，以空白調“0”點，讀取光密度。GPT測定不加檸檬酸苯胺溶液，其他操作方法同GOT測定法。

3. 計算

   1) 由所測得之光密度值直接查標準曲線，即可得知活性單位。

   2) 若用標準管法測定，可用丙酮酸標準液（1ml = 2μmol）0.1ml，按操作測知標準管光密度，按下列方式計算結果：

（測定管光密度/標準管光密度）×200 = 轉氨酶活性 (單位數) / 100ml血清

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