軟骨細胞的原代培養和傳代培養

軟骨細胞的原代培養
齡新西蘭乳兔(雌雄不限，共18只，分6次處理),溺死，置于75％酒精溶液中10分鐘，拿入超凈工作臺，自眼外眥至耳屏前剪開皮膚暴露皮下組織，再次嚴格消毒，自外眥外將顴弓由根部剪斷，暴露髁狀突，去凈髁狀突表面軟組織及軟骨膜，以眼科剪剪取髁狀突表面的透明軟骨，以磷酸緩沖液（PBS含青霉素、鏈霉素各100U/L）沖洗2遍，將軟骨剪切成1－3mm3 左右碎塊，0.25%胰蛋白酶先消化30-35分鐘，PBS浸洗2遍；后置于50ml玻璃培養瓶，加0.1％Ⅱ型膠原酶(DMEM配制)，37消化 3.5－4.5小時，每小時置37℃恒溫振蕩箱振蕩5min。直到軟骨塊大部分呈肉眼可見的絮狀物，倒置顯微鏡下觀察，軟骨細胞大部分分離后，以彎頭吸管輕輕吹打，細胞懸液以1200r/min離心7分鐘，棄上清，以含10％新生牛血清DMEM的培養液終止消化，離心棄上清以洗去細胞表面的酶，懸浮細胞并計數，臺盼藍染色檢測細胞活力為90％。將細胞以2×105/ml接種于25cm2培養瓶內，置于37 ℃恒溫, 5％CO2 濃度,飽和濕度培養箱內培養。2天后換液1次，以后隔天更換培養液，倒置顯微鏡觀察、照相記錄細胞形態及貼壁生長情況。待細胞貼壁達到85％－90％后傳代。
軟骨細胞的傳代培養
待細胞貼滿壁后傳代。傳代時,吸干培養液,用PBS液輕洗細胞2次，培養皿內加入0.25％胰蛋白酶－0.01％EDTA（1比1）消化液,以覆滿瓶底為限,置溫箱2～3 min 后,顯微鏡下觀察到細胞質已回縮,細胞間隙增大，即向培養皿里滴入2 mL 左右含血清的培養液終止消化,收集第1代培養細胞，用彎頭吸管吸取混和液,反復多次輕吹皿底細胞,使細胞徹底從培養瓶底壁脫落,收集細胞混和液, 1200r/min離心7分鐘, 棄上清，以含10％新生牛血清的DMEM清洗細胞3次,制成細胞懸液，將細胞以2×105/ml接種于25cm2培養瓶內，置于37 ℃恒溫, 5％CO2 濃度,飽和濕度培養箱內培養。隔天更換DMEM培養液。以第3代軟骨細胞制成細胞懸液并計數，臺盼藍染色檢測細胞活力為90％，調整細胞濃度為 5×107/ml,用于實驗。
傳代　
吸干培養液,用PBS 液輕洗細胞2次,培養皿內加入0.25 %的胰蛋白酶,以覆滿皿底為限,置溫箱2～3 min 后,顯微鏡下觀察到細胞質已回縮,細胞間隙增大,少部分細胞已浮于消化液中,用吸管吸取混和液,反復多次輕吹皿底細胞,使細胞徹底從培養皿底壁脫落,收集細胞混和液,離心,用PBS 液漂洗2 次,再制成細胞懸液,計數,檢查細胞活力,按每個培養皿接種2 ×105 個細胞再培養。