通過凝膠電泳測定λ噬菌體原種和裂解物中DNA的含量實驗

λ 噬菌體 DNAλ 噬菌體裂解物或原種

2.5X SDS-EDTA 染料混合物DNaseⅠ稀釋緩沖液胰 DNase Ⅰ

瓊脂糖凝膠水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

2.5X SDS-EDTA 染料混合物

2. 酶和緩沖液

DNaseⅠ稀釋緩沖液，胰 DNase Ⅰ (1 mg/ml)

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠

4. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌體 DNA ( 對照 DNA)

5. 專用設備

預置于 65℃ 的水浴

6. 載體和菌株

λ 噬菌體裂解物或原種

二、方法

1. 按如下方法配置胰 DNaseⅠ 的工作液（1 μg/ml)：1 μl DNase Ⅰ 儲液加 1 ml 冰冷的 Dnase Ⅰ稀釋緩沖液進行稀釋。

2. 將封口的試管輕輕上下顛倒數次使溶液混勻，注意別產生氣泡和泡沬。在使用前將工作液貯存于冰浴中，用后舍棄。

平板裂解物的粗制品得到一條清晰的 λ 噬菌體 DNA 帶。但是，液體裂解物一般含細菌 DNA 片段，在瓊脂糖凝膠中將干擾噬菌體 DNA 帶。在用 SDS 和 EDTA 處理釋放 λDNA 之前，先用胰 DNaseⅠ 處理噬菌體顆粒，將能避免該問題的產生。

3. 將 10 μl 噬菌體裂解物或原種的粗制品轉移至一微量離心管中，加 1 μl 胰 DNase 工作液，37℃ 溫育 30 min。

4. 加入 4 μl 2.5X SDS-EDTA 染料混合物，65℃ 溫育 5 min。

這一步使噬菌體的外殼破裂，釋放病毒 DNA，同時使 DNase 失活。

5. 將樣品上樣于含 0.5 μg/ml 溴化乙錠的 0.7% 瓊脂糖凝膠中。

用 5 ng、25 ng 和 100 ng 的 λ 噬菌體 DNA 作對照。

6. 在小于 5 V/cm 的電場下電泳，直到溴酚藍遷移 3~4 cm。

如果電壓太高，DNA 帶將出現拖尾現象。

7. 在紫外線下觀察凝膠。用標準 DNA 的熒光密度作對照，估算測試樣品中 λ 噬菌體 DNA 的量。

10 μl 的高滴度裂解物應含有 10~50 ng 的噬菌體 DNA。