通過欺騙免疫系統來改善血友病基因療法的遞送

　　在一些血友病基因療法中，腺相關病毒(AAV)作為載體來遞送表達功能凝血因子的基因。這種方法的一個局限性是，大多數人已經對AAV產生了自然免疫，這可能使治療無效。近日，由意大利米蘭San Raffaele Telethon基因治療研究所的科學家們領導的一個小組發現了一種可能的方法：通過欺騙免疫系統來改善血友病基因療法的遞送。

　　他們利用天然抑制劑CD47整合到慢病毒載體(LVs)的表面，抵消吞噬細胞對它們的捕獲，結果發現：肝細胞基因轉移效率更高，急性炎癥反應的激活減少；在非人靈長類動物(NHPs)的實驗中，LVs能夠在不引起毒性的情況下將治療基因轉移到肝細胞——體內凝血因子合成的主要場所。這項研究于5月22日發表在Science Translational Medicine雜志上。

　　遞送血友病基因療法，慢病毒載體具有潛力

　　針對遺傳性凝血障礙血友病的肝靶向基因治療是基因治療最成功的應用之一。目前，重組凝血因子VIII或IX(FIX)蛋白替代治療(PRT)分別是A型血友病和B型血友病的標準治療。然而，基因治療可能會在一次給藥后建立一個穩定的組織功能因子來源，從而避免終生頻繁靜脈注射PRT的要求，并有可能提供對該病的徹底治愈。

　　單次靜脈注射重組腺相關病毒(AAV)衍生載體，將凝血因子基因的功能副本運送至肝臟(凝血因子基因的天然生產部位)，已顯示出對血友病患者的安全性和有效性，并有望成為臨床可用的治療選擇。

　　然而，由于AAV載體不能主動整合到宿主細胞基因組中，并且抗AAV免疫反應限制了載體的重新整合，這類基因治療可能難以應用于兒童患者。此外，相當一部分成年患者對AAV預先免疫；因此，他們由于具有中和的抗AAV抗體(Abs)而沒有資格接受AAV載體給藥，或者由于對AAV衣殼的細胞免疫，需要免疫抑制一段時間來維持AAV轉導的肝細胞。

　　在I/II期研究中，基因療法先驅Spark Therapeutics的SPK-8011用于治療A型血友病，使得12名患者的年出血率和輸血需求均下降了97%。然而，值得注意的是，Spark試驗中劑量最高的2名患者(即進入III期試驗的劑量)出現了免疫反應，導致他們的因子水平降至正常水平的5%以下。

　　和AAV一樣，慢病毒(LV)也被用于基因治療。Bluebird Bio的LentiGlobin，旨在治療另外的血液疾病  -β地中海貧血癥和嚴重的鐮狀細胞病，使用LV將人類β-珠蛋白基因的功能性版本插入患者的造血干細胞中。

　　LV由HIV衍生而來，它不像AAV那么流行，因此應該是更好的基因治療遞送載體選擇。研究者認為，隨著時間的推移，AAV療法的療效似乎在減弱，而這正是LV可能擁有的另一種優勢。因為LVs能積極地整合到宿主細胞基因組中，并在細胞分裂時得以維持，如果不與插入突變的顯著風險相關，這對于建立長期表達具有潛在優勢。

　　CD47  -別吃我信號

　　然而，意大利的研究人員注意到，在發揮治療作用之前，LV可以被肝和脾的吞噬細胞(吞噬外來分子的白細胞)清除。

　　眾所周知，CD47蛋白是一種抑制巨噬細胞吞噬的信號分子，信號調節蛋白α(SIRP-α)的特異性配體。

　　因此，圣拉斐爾Telethon基因治療研究所的科學主任Luigi Naldini和同事們假設，將CD47連接到LV可以幫助基因療法逃離巨噬細胞的“魔爪”。

　　整合CD47到慢病毒，逃避免疫從而提高效率

　　研究通過瞬時轉染過表達CD47，構建了先前報道中的LV穩定生產細胞系和293T細胞，用于LV生產。為此，研究人員用CD47表達的自失活γ逆轉錄病毒載體(SIN RVs)轉導這些細胞。

　　在293T細胞和LV生產細胞系(CD47hi細胞)的細胞表面上實現了CD47蛋白穩定10至30倍的過表達。由CD47hi細胞產生的LV在對照293T細胞上具有與親本細胞產生的載體相當的滴度和感染性，并且通過電子顯微鏡顯示CD47的免疫染色顯著增加(P<0.0001)。

　　LV表面上CD47的量不影響包膜蛋白 -水泡性口炎病毒蛋白G(VSV.G)的存在，與CD47hi LV的未改變的感染性一致。當CD47hi和對照LV與巨噬細胞系或原代人巨噬細胞一起孵育時，發現CD47hi LV的攝取顯著降低(P=0.0303)，其達到對照293T細胞中觀察到的基礎水平。相反，人巨噬細胞對無CD47LV的攝取顯著高于對照LV(P=0.0083)。

　　這些數據表明，調節LV顆粒上CD47的量可以影響人巨噬細胞對它們的攝取。

　　在NOD小鼠的體內研究中，CD47hi LV表現出對吞噬作用和先天免疫激活的易感性降低；活體成像顯示，CD47調節KCs(庫弗氏細胞)對LV吞噬作用的速率和程度。

　　NHPs是最接近人類的模型，和人類之間SIRP-α和CD47的序列同源性分別為94%和99%。因此，下一步研究選擇恒河猴作為受試者，因為與其他NHP物種相比，對HIV感染的限制較低。

　　他們證明，LVs向NHP的體內施用(靜脈注射)是安全且耐受良好的，并且表明CD47hi LV對先天免疫系統的活化減少，并且進一步增加肝細胞基因轉移。

　　盡管全基因組LV整合必然意味著對延遲的腫瘤發生的擔憂，但該研究結果顯示在NHP中沒有LV轉導的肝細胞或肝腫瘤擴張的跡象，盡管存在治療個體數量和觀察時間的固有限制。NHP肝臟和脾臟中的LV IS分析顯示出不同的組成，幾乎所有獨特的IS由1-4個基因組代表，表明沒有發生克隆擴增，并且與處理的NHP中大多數肝細胞預期的低至無增殖率一致。

　　此外，迄今為止，在幾項臨床試驗中，LV轉導的造血干細胞(HSCs)或T細胞治療的數百名患者中，沒有任何關于插入性腫瘤發生的證據，這包括對最早接受治療的患者隨訪10年以上。鑒于HSC對致癌轉化的敏感性可能高于肝細胞，這些發現令人放心，并支持LV設計、IS選擇和多克隆重建都有助于減輕這種風險的說法。

　　研究小組補充說，整合CD47可以降低所需的LV劑量，從而緩解制造需求，并降低副作用的可能性。