鄭三多博士等揭示KCTD介導GABAB受體脫敏的分子機制

　　GABAB（γ-氨基丁酸B型受體）是一種抑制性神經遞質受體，屬于C家族G蛋白偶聯受體（GPCR），由兩個亞基組成：GABAB1和GABAB2。激活的GABAB受體使G蛋白異源三聚體解離為Gαi/o亞基和Gβγ二聚體。Gαi/o亞基降低腺苷酸環化酶活性，而Gβγ激活G蛋白偶聯的內向整流鉀通道（G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel，GIRK），使細胞內的鉀離子外流，導致細胞膜的超極化，進而降低動作電位的頻率，減少神經遞質的釋放。

　　為了避免受體在激動劑的持續刺激下處于過度激活狀態，許多GPCR通過β-arrestin介導的脫敏反應終止G蛋白信號。β-arrestin結合處于激活狀態并被磷酸化的GPCR，阻止G蛋白的進一步結合，同時介導GPCR的內吞。在體內，GABAB受體激活的GIRK通道電流在數秒后快速被關閉，而β-arrestin介導的脫敏反應所需時間比較長，通常在數分鐘后，因此不能夠解釋GIRK通道的快速失活。來自德國Dr. Berhard Bettler實驗室通過親和純化以及定量質譜方法發現KCTD家族（屬于鉀離子通道蛋白四聚體家族成員）可以與GABAB受體結合【1】，在受體激活后，KCTD將Gβγ從GIRK通道競爭下來，導致離子通道的快速關閉，但是KCTD識別GABAB受體以及其快速清除結合在GIRK通道上Gβγ的分子機制仍然不清楚。

　　2019年2月27日，哈佛醫學院Andrew Kruse課題組鄭三多博士等在Nature上在線發表題為Structural basis for KCTD-mediated rapid desensitization of GABAB signaling的研究論文。該研究結合X射線晶體學、電子顯微鏡、生化以及電生理等方法闡明KCTD識別GABAB受體以及Gβγ的分子機制，首次揭示除β-arrestin以外的GPCR信號脫敏機制, 為探索GABAB受體下游藥物作用靶點提供新的思路，同時為研究其它GPCR信號快速脫敏機制提供重要指導。

　　KCTD蛋白主要含有N端的BTB結構域和C端H1結構域。通過體外pull-down方法發現GABAB2亞基的胞內C末端約30多個殘基可以與BTB結構域結合，隨后解析KCTD BTB結構域與GABAB2 C末端的晶體結構，結構顯示BTB結構域形成環狀非對稱的同源五聚體結構，包圍GABAB2亞基的C末端（圖1b），

圖1： a，KCTD與GABAB2的結構域組成；b，KCTD16 BTB結構域與GABAB2的C末端（876-913）的晶體結構。

　　隨后體外pull-down實驗發現KCTD12可以同時結合GABAB2以及Gβγ二聚體，但是不能結合Gαβγ三聚體（圖2a）。負染電子顯微鏡實驗發現KCTD的H1結構域形成對稱的同源五聚體結構，結合五個拷貝的Gβγ（圖2b）。為了深入了解它們相互作用的機制，解析KCTD12 H1結構域與Gβγ的晶體結構（圖2c）。與電鏡結果一致，KCTD-Gβγ復合物形成五次對稱的同源五聚體結構，其中H1結構域形成類似β-propeller的結構，被五個拷貝的Gβγ緊密包圍。每個H1亞基同時結合兩個拷貝的Gβγ，參與相互作用的關鍵殘基的突變導致KCTD失去抑制GIRK離子通道的能力。

圖2，a, GST pull-down實驗；b，KCTD-Gβγ復合物的凝膠過濾層析實驗以及相應的電鏡負染2D；c, KCTD12 H1結構域與Gβγ的晶體結構。

　　有趣的是與H1結構域結合的五個拷貝的Gβγ之間有相互作用（圖2c），表明它們之間的結合具有協同性，而2013年諾貝獎獲得者Roderick MacKinnon解析的GIRK-Gβγ晶體結構顯示四個拷貝的Gβγ與GIRK同源四聚體結合【2】（圖3），Gβγ之間是相互獨立，沒有直接相互作用。此外KCTD-Gβγ相互作用的親和力要大于GIRK-Gβγ，這些為KCTD快速清除結合GIRK通道上的Gβγ提供重要的結構基礎。

圖3，GIRK與Gβγ的晶體結構2

　　該研究系統解釋KCTD如何在時間和空間上精確調控GABAB信號轉導（圖4）：a，當GABAB受體被激活，Gβγ與Gα分離。由于本身的脂肪酸修飾，Gβγ仍然錨定在細胞膜上，所以可以快速與定位在細胞膜上的GIRK結合，激活GIRK；b，結合在GABAB2亞基C末端的KCTD在空間上與GIRK-Gβγ非常接近，KCTD與Gβγ結合的高親和性以及協同性使它能夠快速地清除結合在GIRK通道上的四個拷貝Gβγ，從而導致GIRK失活，隨后結合GDP的Gα可以與Gβγ重新結合，進行新一輪的信號轉導。

圖4，KCTD介導GABAB受體脫敏的分子機制。

　　據悉，據悉本論文第一作者是哈佛醫學院博士后鄭三多，通訊作者是哈佛醫學院的Andrew Kruse教授。

　　鄭三多博士，2013年在北京生命科學研究所葉克窮實驗室獲得博士學位，2015年加入哈佛醫學院Andrew Kruse實驗室進行博士后研究，2019年6月即將擔任北京生命科學研究所研究員，博士生導師。主要研究方向是神經系統中膜受體信號轉導以及跨膜轉運蛋白轉運的分子機制，其研究成果主要發表在Nature (Zheng et al., 2019； Schmidt# and Zheng# et al., 2016)、Cell（Huang# and Zheng# et al., 2018）、PNAS（Zheng et al., 2018）和Genes & Development（Zheng et al., 2014）等學術期刊上。目前鄭三多實驗室正在籌建中，歡迎對他的研究領域感興趣的博士后和研究生與他本人聯系（郵箱：sanduo_zheng@hms.harvard.edu）

　　原文鏈接：

　　https://www.nature.com/articles/s41586-019-0990-0

　　參考文獻

　　1. Schwenk, J. et al. Native GABA(B) receptors are heteromultimers with a family of auxiliary subunits. Nature 465, 231-235, doi:10.1038/nature08964 (2010).

　　2. Whorton, M. R. & MacKinnon, R. X-ray structure of the mammalian GIRK2-betagamma G-protein complex. Nature 498, 190-197, doi:10.1038/nature12241 (2013).