1．原理 用酰化劑3--（4-羥苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter試劑）做連接試劑，將125I標記在羥苯基的2，5位置上，再將琥珀酰胺酯水解，通過一個酰氨鍵將3--（4—羥基—5—125I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。
2．方法 125I—Bolton—Hunter試劑可用氯胺T法自行制備，出已有該試劑的苯溶液作為商品出售。使用時取一定量的標記酯（μmol 蛋白用3～5μmol標記酯），用氮氣吹除苯，投入欲標記蛋白5～10μg及緩沖液10～50μl,pH8.0～8.5為宜，在冰浴中反應15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使過量標記酯消耗掉以終止反應。
此法避免了蛋白質與氧化劑的接觸，又避免了與放射性碘原子的直接接觸，可防止碘源中有害物質對蛋白質的損傷，適用于標記缺乏酪氨酸的蛋白質或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后會引起蛋白質的失活。其缺點是標記技術比較復雜，需要接觸較多的放射性，經二步反應，碘標記率比較低。一般認為此法不宜標記短肽，而適于分子量大于1萬的蛋白質。