重大突破！科學家利用iPSC首次培養出高度成熟神經元

　　自 2006 年山中伸彌等發現了將體細胞誘導為多能干細胞的奧秘后，越來越多研究者的目光聚集到了這一領域。人們相信誘導多能干細胞（iPSC）可被用于廣泛的體外研究，甚至用于更加精準的定制化細胞療法中。不過，盡管研究人員已經可以分化干細胞成為神經元，但這些神經元在功能上還是不成熟的，這極大的影響了iPSC衍生神經元的應用和研究潛力。

　　2023 年 1 月 12 日，西北大學的研究者們在體外條件下由 iPSC 創造出了高度成熟的人類神經元，這項工作將為神經退行性疾病以及創傷治療領域的研究開辟新的機會。

　　Samuel I. Stupp 博士與 Evangelos Kiskinis 博士團隊利用超分子納米纖維（supramolecular nanofiber）生成適用于神經元的細胞外環境（ECM），誘導了細胞的分化以及功能形成。該項研究以 Artificial extracellular matrix scaffolds of mobile molecules enhance maturation of human stem cell-derived neurons 為題，在 Cell Stem Cell 期刊上線上發布。[1]

　　超分子納米纖維——新型 ECM

　　利用 iPSC 模型研究人類神經系統相對體內研究有著諸多優勢。然而其重大的限制之一是無法有效模擬成熟神經元的功能。文章通訊作者 Stupp 博士說：“將 iPSC 誘導成為神經元，我們得到的是初生神經元。但想要在疾病治療的研究中發揮作用，我們需要成熟的神經元。否則就如同讓一個孩子去干成人才能完成的活兒了。”[2]

　　為了突破這一難題，研究團隊試圖從神經元的 ECM 入手。經過長期的研究，人們普遍認為 ECM 對于細胞功能的維持、細胞分裂、自體更新以及干細胞分化等都起著重要的作用。[3] 針對 iPSC 誘導神經元的研究，當前的可及的 ECM 方案主要采用了二維平面上包被 laminin的方式，而 laminin 是體內神經元 ECM 的主要成分之一并在成熟的脊髓的細胞中高表達。然而，在類似的二維環境中，神經元常常產生大量聚集，這不僅使得利用高分辨率顯微鏡進行觀察極其不便，也不可避免地阻礙了神經元的成熟，以及后續的相關研究。于是，研究團隊創造性地利用超分子納米纖維生成了神經元 ECM。

　　該種超分子納米纖維由肽兩親分子（peptide amphiphiles，PA）自組裝形成，暴露在表面的是源于 laminin α-1 的肽段（異亮氨酸-亮氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸）。研究團隊針對性地對中間的鏈接部分進行了優化改造，從而創造出了三種具有不同移動性的超分子納米纖維 PA1、PA2 與 PA3。團隊首先利用冷凍透射電鏡與掃描電鏡（cyro-TEM 與 SEM）驗證了肽兩親分子的成功自組裝，接著用窄角 X 光散射（SAXS）、廣角 X 光散射 （WAXS）、原子力顯微鏡（AFM）、弛豫核磁共振光譜（T2-NMR）等驗證了超分子納米纖維的結構，并展示了 PA2 相對于 PA1 與 PA3 的高流動性、高移動性與高水合性。

　　超分子納米纖維支持神經元成熟化

　　團隊將由人類 iPSC 誘導的運動神經元生長在由 PA1、PA2、PA3 超分子納米纖維形成的 ECM 或者商業化的 laminin ECM 上，均觀察到有效的細胞貼附。納米纖維培養的細胞β1-integrin（ITGB1）高表達，且在納米纖維上的細胞貼附依賴于 ITGB1。

　　接著，團隊將細胞培養的時間延長到 60 天，驚奇地發現在納米纖維上細胞生長良好，而 laminin 上的細胞層厚度大大減小。通過蛋白質譜以及基因聚類分析，團隊識別到多個重要通路，包括“細胞-基質貼附”、“肌絲-微觀組織”、“細胞運動調控”以及“細胞凋亡”等通路在納米纖維上的運動神經元中得到調控。而這些通路中的大多數都已在之前的研究中被確定可以被 intergrin 調控。細胞層面上，納米纖維培養的細胞存活率較 laminin 更高。而其中 PA2 培養的細胞，則有更大的神經元胞體，更長、更復雜的分支形成以及更廣泛均勻的細胞分布。

　　神經元功能性上，團隊展示了 PA2 培養的神經元細胞相較 PA1、PA3 和 laminin 培養的細胞有更高的突觸前和突觸后相關蛋白表達。利用單細胞膜片鉗，團隊發現 PA2 培養的細胞產生更強更密集的電位；多電極陣列也顯示了類似的結果。這些均說明 PA2 培養的細胞更加成熟，功能也更完備。

　　超分子納米纖維支持

　　神經退行性疾病的新型體外模型構建

　　為了探索利用該納米纖維研究神經退行性疾病的可能性，團隊選取了肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）作為模型。團隊將一種被廣泛運用的 ALS 細胞模型，SOD1+/4AV 培養在 PA2 上。團隊發現與 laminin 培養相比，PA2 培養的突變細胞表現出更多的 SOD1 與 ubiquitin 蛋白聚集，而這正是 ALS 發病的組織學特征之一。

　　文章另一位通訊作者 Kiskinis 博士指出：“這是我們第一次能夠在 iPSC 誘導的體外實驗中看到成人 ALS 神經元的錯誤蛋白聚集，這是一項突破。雖然我們目前還不知道出現這一癥狀的原因，但我們期待在未來可以更好地解釋該疾病。”[2]

　　本研究突出展現了利用具備高流動性的超分子納米纖維構建 ECM，使得 ECM 與神經元的接觸更加動態化的新型體外培養方式。這可以更好地維持神經元功能，促進神經元成熟。以該培養方式為基礎的體外模型，可以用于包括肌萎縮側索硬化癥、阿爾茲海默癥、帕金森病在內的各項神經系統疾病的研究。更進一步地，提取病人的細胞進行重編程，以生成正常的細胞用于治療各項疾病也將成為可能。