重組DNA的轉化實驗原理和操作步驟

實驗目的

制備出感受態細胞，把體外重組的DNA引入受體細胞，使受體菌具有新遺傳性，并從中選擇出轉化子。

實驗原理

感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。pUC18的LacZ基因區域當有DNA片段插入時，LacZ基因失活，轉化進入大腸桿菌并在含有IPTG和X-gal培養基生長時，會產生白色的克隆，不含插入片段的pUC18質粒進入宿主細胞生成藍色菌落。

實驗操作

（一）受體菌的培養與CaCl2 處理（無菌操作）

1、取0.3ml種子液接到裝有30 ml LB液體培養基的三用瓶中，振蕩培養2-2.5小時

2、取出一定量菌液置于冰浴10分鐘

3、4，000rpm，4℃離心5分鐘，收集菌體

4、把菌體懸浮在4 ml 100mM冷CaCl2 中，冰浴25分鐘。

5、5，000rpm，4℃離心5分鐘，收集菌體

6、再把菌體懸浮在1ml 100 mM冷CaCl2 中置4 ℃ 12-24小時，備用。

（二）倒皿鋪平板

1、按照各組轉化反應的混合物

控制不同的選擇性培養基（20 ml/皿）

LB固體培養基（100 ml）Amp（60μg/ml）Tet（40μg/ml）供連接混合物轉化，pUC18轉化用，共5皿

LB固體培養基（100 ml）Amp （60μg/ml）X-gal （40μg/ml）IPTG（24μg/ml），供連接混合物轉化，pUC18轉化用，共5皿

2、轉化反應前一天，先鋪好平板

3、取各組反應物在平板上涂布

4、培養皿倒置于37℃培養箱中過夜

5、觀察轉化子出現的情況

（三）轉化反應

待轉化DNA的準備

我們需將連接混合物，提取的pUC18兩種樣品作轉化反應，按下表準備

取上述兩組混合物在Eppendorf管中，按如下處理：

1、將各組Eppendorf管置冰浴/小時以上

2、把上述樣品置42℃水浴中，2分鐘

3、轉移到37℃水浴中5分鐘，加800μl LB液體培養基

4、在37℃搖床上振蕩培養1小時，取25μl涂皿