金黃色葡萄球菌一氧化氮合成酶NOS調控萬古霉素耐藥性

　　金黃色葡萄球菌是人類重要機會性致病細菌，由甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌（MRSA）引發的感染正嚴重威脅公共健康安全。萬古霉素被認為是臨床上治療嚴重MRSA感染的最后一道防線，其中度耐藥性菌（VISA）的頻繁出現，為MRSA的感染治療帶來了巨大挑戰。

　　一氧化氮（NO）可由一氧化氮合成酶（NOS）產生，參與調節各種生理功能。NO可通過對蛋白質半胱氨酸殘基的巰基進行S-亞硝基化修飾影響蛋白質的活性和功能。金黃色葡萄球菌攜帶NOS，且被報道參與調控金黃色葡萄球菌的萬古霉素耐藥性，但相關分子機制尚不明確。

　　近日，中國科學技術大學生醫部孫寶林課題組與首都醫科大學附屬北京兒童醫院于丹課題組合作（孫寶林課題組的舒雪琴博士為第一作者），在 Nature Communications 期刊發表了題為：Transcription tuned by S-nitrosylation underlies a mechanism for Staphylococcus aureusto circumvent vancomycin killing 的研究論文。

　　該研究揭示了金黃色葡萄球菌一氧化氮合成酶（NOS）及其內源產生的一氧化氮（NO）在促進萬古霉素抗性中的作用機制：細菌NOS來源的NO通過介導MgrA或WalR發生S-亞硝基化修飾，促進他們對自溶相關靶基因的負調控功能，導致細胞的自溶活性下降，介導細胞壁厚度增加，進而促進金黃色葡萄球菌的萬古霉素耐藥性。該研究有望為臨床治療VISA及其他細菌病原體的感染提供新的思路與策略。

　　基于NO可對蛋白質半胱氨酸殘基的巰基進行S-亞硝基化修飾，研究人員首先采用蛋白質修飾組學分析鑒定了金黃色葡萄球菌中可被內源NO亞硝基化修飾的蛋白靶點，并聚焦在與自溶活性、耐藥性以及毒力具有重要調控功能的MgrA上，其上位于第12位的唯一半胱氨酸Cys12發生了S-亞硝基化修飾。為了驗證蛋白組學的結果，研究人員通過western blot對MgrA由NO介導的S-亞硝基化修飾進行了驗證。

　　修飾組學揭示內源NO造成MgrA的S-亞硝基化修飾

　　為了探究MgrA的S-亞硝基化修飾對VISA菌株萬古霉素耐藥性的影響，研究人員將半胱氨酸突變為不能發生修飾的絲氨酸或丙氨酸（C12S或C12A）。發現MgrA點突變菌株與NOS敲除株類似，均表現出對萬古霉素的抗性顯著下降。研究者發現外源添加NOS抑制劑亦會導致VISA菌株對萬古霉素耐藥性降低。此外，外源性添加NO供體SNP可以促進NOS敲除株對萬古霉素的耐藥性，而對MgrA點突變菌株與的耐藥性沒有促進作用，表明NOS產生的低濃度NO及其介導的MgrA S-亞硝基化修飾在促進金黃色葡萄球菌萬古霉素耐藥性過程中發揮了重要作用。

　　VISA菌株常表現為細胞壁增厚以及細胞自溶活性下降。研究人員發現，MgrA點突變菌株和NOS敲除株的細胞壁厚度均發生下降，細胞自溶活性均顯著增加。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）結果顯示部分自溶相關基因的轉錄水平發生明顯上調，表明MgrA的S-亞硝基化修飾可能通過對自溶基因的調控進而調控細胞的自溶活性以及影響細胞壁厚度，進而增強金黃色葡萄球菌對萬古霉素的抵抗能力。

　　有研究發現，MgrA可通過與下游靶基因的啟動子結合發揮直接的調控作用，因此研究人員猜測S-亞硝基化修飾可能會通過影響MgrA與其靶標基因的啟動子結合進而發揮調控功能。通RT-qPCR、染色質免疫共沉淀-qPCR、凝膠阻滯遷移實驗等方法表明NO介導的MgrA的S-亞硝基化修飾通過影響MgrA與下游靶基因啟動子的結合能力，從而干擾自溶相關基因轉錄，降低細菌自溶活性。

　　為了探究金黃色葡萄球菌中是否還存在其他轉錄因子利用類似的調控機制參與萬古霉素耐藥性的發生，研究人員對質譜鑒定到的另一個在第67位半胱氨酸發生修飾的轉錄調控因子WalR進行了研究，發現WalR的C67S點突變菌株表現出與NOS敲除株和MgrA點突變菌株類似的現象：對萬古霉素的抗性顯著下降、細胞壁變薄以及細胞自溶活性增加，并展現了與MgrA中類似調控機制。以上結果表明金黃色葡萄球菌NOS內源產生的NO通過S-亞硝基化修飾介導的轉錄調控機制在細菌中可能具有普遍性。

　　總的來說，該研究利用修飾組學分析鑒定了金黃色葡萄球菌NOS內源NO的S-亞硝基化修飾靶點，揭示了細菌NOS及其內源產生的NO通過介導靶蛋白的S-亞硝基化修飾以促進萬古霉素耐藥性發生的具體分子機制，加深了我們對金黃色葡萄球菌萬古霉素耐藥性發生機制以及NO信號分子作用方式的認識。該研究提示細菌NOS特異性抑制劑、NO清除劑或S-亞硝基化修飾抑制劑等的開發，有望為臨床治療VISA及其他細菌病原體的感染提供新的思路與策略。

　　中國科學技術大學生命科學與醫學部孫寶林教授、國家兒童醫學中心首都醫科大學附屬北京兒童醫院于丹副教授為本論文的通訊作者；孫寶林教授課題組的舒雪琴博士為本論文的第一作者；研究生石瑩瀅、黃奕也為該工作做出了貢獻。感謝第三軍醫大學的饒賢才教授對本研究提供的幫助與支持。