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  • 發布時間:2019-04-05 12:11 原文鏈接: 銀染核仁形成區的標本制備及觀察實驗

    近年來發現,雖然人的端著絲粒染色體短臂是28S、18S、和5.8S rRNA基因存在部位,稱核仁形成區,但銀染的物質不是rDNA和rRNA,而是與活性的rDNA轉錄有關的一類酸性蛋白質,容易將Ag離子還原為Ag的顆粒,從而在核仁形成區鍍上銀、呈棕黑色,稱為銀染核仁形成區。

    實驗方法原理生化和免疫化學研究證明銀染蛋白是RNA聚合酶I,其功能是催化rDNA轉錄rRNA形成核仁,因此通過這種反應能夠特異顯示rRNA轉錄的活性。
    實驗材料

    HL-60細胞HeLa細胞

    試劑、試劑盒

    Carnoy固定液HCl甲酸AgNO3蛋白膠硫代硫酸鈉戊二醛乙醇丙酮醋酸鈾檸檬酸鉛染液

    儀器、耗材

    顯微鏡電子顯微鏡超薄切片機水浴箱離心機天平染色缸平皿乳頭吸管離心管擦鏡紙

    實驗步驟

    一、中期染色體核仁形成區的銀染和觀察


    1.  取制備好的正常或腫瘤細胞染色體標本,直接放入裝有5 N HCl溶液中,常溫處理5分鐘。


    2.  用自來水反復沖洗幾次,甩干,標本面朝上平放在平皿中。


    3.  將0.1%甲酸臨用前配制的50%AgNO,溶液約0.5 ml,用吸管滴在標本上,再蓋上二片擦鏡紙。


    4.  放置平皿于56℃水浴中處理3~5分鐘,待擦鏡紙呈棕色后,取出標本用水沖洗、氣干。


    5.  鏡檢


    (1)鏡下所見標本背景淺黃色,核型深染,端著絲粒染色體的銀染蛋白存在的部位呈棕黑色顆粒,選擇染色體分散良好,銀染顆粒清楚的分裂相,進行計數單側或雙側有銀染顆粒的染色體數。


    (2)人體細胞銀染顆粒有遺傳穩定性,一般正常值為4~8個/核型。

     

    (3)計算方法:NOR   均值=N個核型中含NOR染色體數的和/N個核型


    二、間期細胞核活性核仁形成區的銀染與觀察


    1.  收集培養的HL-60細胞和用PHA轉化的人正常外周血淋巴細胞分別于離心管中,用1 000 rpm 離心5分鐘后棄上清。


    2.  用吸管吸打或用指彈法使細胞懸浮,然后用Carnoy固定液固定30分鐘。


    3.  以1 000 rpm 離心5分鐘,棄上清剩約0.5~0.1 ml 液體,使細胞懸浮后滴片。


    4.  37℃干燥24小時


    5.  銀染


    6.  鏡檢


    (1)鏡下所見,細胞核著色而細胞質不著色,核中活性核仁形成區銀染顆粒呈棕黑色,成簇聚集,清晰可分。

    (2)腫瘤細胞中與正常細胞中的銀染顆粒數量、可見有明顯差異。


    三、間期細胞核銀染活性核仁形成區電鏡標本制備與觀察


    1.  收集培養的HL-60細胞或HeLa細胞于離心管中,隨后加入2.5%戊二醛1 ml 預固定10分鐘。


    2.  以1 000 rpm 離心10分鐘,棄上清后加入Carnoy固定液固定5分鐘。


    3.  接著以2 500 rpm 離心10分鐘,棄凈上清并用吸水紙吸干殘余液體,用耳勺取出細胞團塊放于小平皿中。


    4.  100%乙醇→雙蒸水梯度復水,每步5分鐘。


    5.  然后將細胞團切成約1 mm3大小的塊。


    6.  將50%AgNO3(用蒸餾水配制)-2%蛋白膠(用1%甲酸配制)2:1混合液2~3 ml,加入有細胞團塊的小平皿中。


    7.  移置平皿于56℃水浴中處理20分鐘。


    8.  徹底水洗3次,每次2~3分鐘。


    9.  水洗后5%硫代硫酸鈉室溫處理10分鐘。


    10.  再水洗3次,轉入乙醇一丙酮梯度脫水,每步5分鐘。


    11.  Epon812包埋。


    12.  超簿切片直接地或再經醋酸鈾和檸檬酸鉛復染后,在電鏡下觀察。

    展開


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