間接ELISA中試劑的配制及反應流程

實驗概要

間接ELISA是一種很實用而常用的免疫分析方法，本文將對反應中所用到的試劑的配制方法和反應的流程進行闡述。

主要試劑

1. 包被緩沖液：(0.05 mol/L，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)

   Na₂CO₃ 1.59g

   NaHCO₃ 2.93g

 蒸餾水 1000ml

4℃保存，一周內用完。

2. 磷酸鹽緩沖液(PBS，PH 7.4)

   NaCl 8.0g

   KH₂PO₄ 0.2g

   KCl 0.2g

   Na₂HPO₄.12H₂O 3.65g

 蒸餾水 1000ml

3. 洗滌液(0.01 mol/L，pH7.4的PBST)

   1L PBS中加入0.5ml Tween-20

4. 封閉液(5% 脫脂奶粉)

   5g 脫脂奶粉加入100ml PBS緩沖液中。

5. 一抗及二抗稀釋液(2% 脫脂奶粉)

   2g 脫脂奶粉加入100ml PBS緩沖液中。

6. 配制顯色液所需試劑：

   1) 0.1M 檸檬酸(1.05g檸檬酸 50ml雙蒸水)

   2) 0.2M Na₂HPO₄.12H₂O (7.1628g Na₂HPO₄.12H₂O 100 ml雙蒸水)

   3) 1% TMB (10mgTMB 200μl無水乙醇 800μl水)

 這三種溶液均須現用現配。

 7. 顯色液：

 分別取A液 24.3ml，B液25.7ml，混合后加入50ml 雙蒸水。然后從中取出9.9ml移入新試管中，再加入100μl C液，最后加入10μl 30% H₂O₂。

 注意：30% H₂O₂溶液應避光保存。C液和H₂O₂溶液最好在臨用前加入。

8. 終止液(2M的H₂SO₄)
    11 ml濃硫酸 89ml水

實驗步驟

1. 包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至最適濃度(如2μg/ml)，每孔加入100μl稀釋好的抗原，于4℃下過夜。

2. 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘。洗滌時將板子放在96孔板振蕩器上，600轉/分鐘。

3. 封閉：每孔加入300μl封閉液，放于濕盒中，37℃，孵育2h。注意要將濕盒提前放入37℃溫箱中預熱。

4. 洗滌：同步驟2。

5. 加一抗，即被檢血清：每孔加入用一抗稀釋液稀釋好的被檢血清100μl，放于濕盒中，37℃，孵育1h。注意設置陽性和陰性對照。

6. 洗滌：洗滌方式同步驟2，次數為4次。

7. 加酶標二抗：按商品化酶標二抗的推薦濃度或者預實驗中較好的濃度稀釋二抗，每孔加100μl，放于濕盒中，37℃，孵育1h。

8. 洗滌：同步驟6。

9. 加顯色液：每孔加100μl顯色液，避光反應15分鐘。

10. 終止：每孔加入50μl終止液。

11. 讀數：將ELISA反應板放入酶標儀中，讀取OD值。注意酶標儀應提前15分鐘打開預熱，還有讀數前最好用酒精棉球擦拭反應板底部，以除去指痕等污漬。

方法評論