非標記抗體免疫電鏡技術

一、原理

標記抗體法雖然具有許多優點，但也存在一些難以克服的問題，如標記抗體的分子增大，對細胞膜和組織的穿透力減弱；化學交聯反應對抗體和酶的活性有所影響；結合物中未標記的抗體可與抗原競爭結合，影響檢測方法的敏感性等。不標記抗體法可以避免上述的不利影響因素，通過一系統的非標記抗體的免疫學反應，對組織中的抗原進行定位檢測。不標記抗體法又可分為用標記物顯示和不同標記物顯示兩種方法。前者利用基因工程方法制備雙特異性抗體的F(ab′)2，一個Fab片段與標本中的抗原結合，一個Fab是抗體蛋白的結合片段。在抗體與標本作用后，再加入鐵蛋白與抗體結合，從而顯示組織內抗原的所在部位。后者則用磷酸鎢負染后，直接電鏡觀察。

二、材料及試劑

1．待檢病毒材料  如糞便，氣管分泌物、腦脊髓液、組織培養液等。

2．高速離心機

3．已知抗體

4．磷鎢酸

5．瓊脂糖

6．其它

三、操作方法

1．經典法

① 將被檢病毒材料0.9ml，加1︰5～1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合。

② 置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃過夜。

③ 以17 000r/min～23 000r/min離心90min。

④ 吸去上清，將離心管口倒置于濾紙上，吸去殘留液體。

⑤ 沉淀物中加少量H₂O混懸，用3%磷鎢酸(pH6.0)負染20Sec～30Sec，滴加于400目銅網Fomnvar膜上，用濾紙從銅網邊緣輕輕吸去多余的負染液。

⑥ 在透射電鏡下4×10⁴倍觀察。

2．快速法(瓊脂擴散法)

① 制備免疫復合物。

② 以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩沖液制備1%瓊脂糖，趁熱澆注于潔凈的載玻片上，每片3ml，待冷卻凝固后，在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數粒，再于凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml～3ml，冷卻凝固后，取出玻璃珠，使凝膠形成凹孔。

③ 將普通濾紙剪成2×3cm大小，3～4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊,每塊帶有一個凹孔,平放在濾紙上。

④ 在凹孔內，加入制備好的含病毒的免疫復合物懸液。

⑤ 將電鏡載網的Fomnvar膜面向下倒懸于液滴上。由于瓊脂糖的吸水作用，20min～30min后，可將液滴的水分吸干，而濃縮的免疫復合物則粘附在載網膜上。

⑥ 在載網膜上滴加3%磷鎢酸負染20Sec，過量的負染液用濾紙在載網邊緣輕輕吸去。

⑦ 于透射電鏡4×10⁴倍下觀察。

四、結果判定

直接觀察病毒粒子的形態。由于離心濃縮的處理和特異性抗體的加入，大大提高了觀察的敏感性。