1. 如基本方案步驟1所述，用SDS-聚丙烯醜胺凝膠電泳分離樣品，使用含100 μmol/l 釩酸鈉的轉移液將蛋白質轉印至硝酸纖維素濾膜上。
2. 在塑料容器內，膜與不含疊氮鈉的封阻液在室溫溫育至少30 min。
3. 室溫下膜與30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗體溫育60~120 min，間或搖動。
4. 在一干凈的塑料容器內，用TN緩沖液冼膜2次，每次10 min；用含0.05%NP-40的TN緩沖液洗膜2次；毎次10 min 再用TN緩沖液洗膜2次，毎次5 min 棄冼液。
5. 加入30~50 ml 針對第一抗體的過氧化物酶偶聯的第二抗體，室溫溫育60 min，間或搖動。
6. 如步驟4所述洗膜。
7. 在比膜稍大的塑料容器內，等體積混合用于ECL檢測的魯米諾試劑和氧化劑。
8. 將膜（含蛋白質樣品的一面朝上）浸入混合試劑，輕搖60 s。
9. 取出膜，瀝干多余液體，置于塑料保護膜內，蛋白質朝上。
10. 在暗室內對X光片曝光15 s~30 min。 展開 | 