食品中蛋白質的測定

　　原理

　　向樣品中加入濃硫酸和催化劑，充分混勻，然后加熱消化分解，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水，其中的有機氮轉化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。

　　取樣

　　由于食品種類繁多，形態及含氮量不一,因此取樣應均勻，稱樣量應準確合理。對取樣較困難的半固體(如冰淇淋)可置于已記重的紙片上稱重(樣品重=總重-紙片重) ,樣品稱好后,與紙片一起置于凱氏燒瓶底部。為減少系統誤差可于空凱氏燒瓶中同時投入相同規格的紙片一張同時作空白。對于不同含氮量的食品，為保證終點滴定消耗酸的體積數在有效范圍,取樣量應視樣品含氮量而定,-般含量在5 %~ 20 %的應精確稱取(1.0~2.0)g(如糕點等) ；對含量在0.1 %~ 1.0 %的應相應增大取樣量,以(5.0~ 10.0)g為宜(如淀粉等) ；對于高含量的(蛋白質大于30 %)的應減少取樣量,以(0.2~1.0)g為宜(如大豆粉等)。

　　樣品消化

　　濃硫酸具有脫水性和氧化性，可使有機物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水，蛋白質會分解為氨，然后氨與硫酸結合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點，一般情況下，純硫酸的沸點在340 ℃左右，但是在添加硫酸鉀后，可提高至400 ℃以上。提高溫度使有機物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀，否則會因為溫度過高，使生成的硫酸銨發生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外，還可以指示消化終點的到達，有機物全部消化完全后，溶液呈現清澈的藍綠色，硫酸銅還可以做蒸餾時堿性反應的指示劑。

　　蒸餾

　　消化液中的硫酸銨在堿性環境下會轉化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出，影響測定結果，所以水蒸氣發生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強酸弱堿鹽，需要足夠的堿液使結合態的氨完全反應并釋放出來，這個過程中的氫氧化鈉一定要過量，過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法，NH4 或NH3遇奈氏試劑會反應生成棕紅色的碘化汞銨化合物。

　　吸收

　　加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時指示劑的變色反應。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過40 ℃。

　　滴定

　　待吸收完全后，用硫酸或者鹽酸標準溶液進行酸堿滴定，滴定液的濃度直接影響結果的準確性，必須按照要求進行配制和標定。混合指示劑在中性溶液中呈灰色，滴定終點時液體呈灰色。

　　注意事項

　　①所用的試劑溶液應用無氨蒸餾水配制；

　　②取樣應具有代表性,取樣前將樣品充分混勻；

　　③樣品稱量放入凱氏燒瓶時，切勿使樣品粘附在瓶頸部，避免樣品未消化完全而造成氮損失；

　　④為了保證使燒瓶壁上的殘渣消化完全，在消化過程中要不時地轉動凱氏燒瓶；

　　⑤消化脂肪或糖含量較高的樣品時，易產生大量泡沫，為防止泡沫溢出，消化時應先消化加熱并不斷搖動，或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑；

　　⑥當樣品消化液渾濁或未澄清透明時，可先將凱氏燒瓶放冷至室溫后，再加入30%的過氧化氫，然后繼續加熱消化；

　　⑦加堿后，漏斗要進行水封，避免因裝置漏氣造成氨的逸出影響結果的準確性；

　　⑧要保證蒸餾裝置不能漏氣；

　　⑨在蒸餾時反應室與外界存在的壓力差，蒸汽可將氨帶出。故蒸餾時，要保證蒸汽均勻、充足，中間不能停止加熱，防止發生倒吸；

　　⑩蒸餾前如果加堿后消化液呈藍色而沒有生成氫氧化銅沉淀，說明加入的堿量不足，需要適量補加堿；,蒸餾時為防止水蒸氣發生器內液體爆沸，加入幾片碎瓷片或大的玻璃珠，玻璃珠直徑最好大于聯通的玻璃管直徑，以免玻璃珠進入玻璃管內影響蒸汽均勻、充足的輸出； -冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，防止氨逸出，蒸餾完畢后先將冷凝管下端提離液面，再蒸1 min后清洗管口，再移開吸收瓶，最后關掉熱源，否則可能發生倒吸。

　　凱氏定氮法誤差分析

　　氮含量與蛋白質含量的折算

　　蛋白質主要由氨基酸構成，不同種類氨基酸的氮含量不同，因此計算含氮量和蛋白質含量時需根據實際情況選取適當的折算系數，否則會帶來很大的誤差。例如，一-些小分子的氨基酸、堿性氨基酸、氨基酸酰胺等氮元素的含量高于平均水平，如果待測樣品中這類的氨基酸含量較高，為測量的準確性需要調整折算系數，否則會導致計算結果比真實的含氮量高。在標準中給出測最時計算的表達式如式(1) :

　　使用公式要根據待測樣品的種類選取合適的F值，具體取值情況如下: 一般食物F=6.25； 純乳與純乳制品F=6.38；面粉F=5.70；玉米、高粱F=6.24；花生F=5.46；大米F= 5.95；大豆及其粗加工制品F=5.71；大豆蛋白制品F=6.25；肉與肉制品F= 6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥F=5.83；芝麻、向日葵F=5.30；復合配方食品F=6.25。

　　多次測量取平均值減小偶然誤差

　　整個測量中涉及大量試劑的配制使用，操作與讀數，各種環境因素的干擾等，這些都會使測量中產生偶然誤差，因此在蛋白質含量的測量中，最終測量結果需要進行多次重復性試驗，并將得到的結果取算數平均值表示，以此減小測量的偶然誤差，并且如果待測樣品蛋白質的含量即:X≥1 g/100 g，其結果需要保留三位

　　有效數字:如果待測樣品蛋白質的含量即: X<1 g/100 g,其結果只需要保留兩位有效數字即可。

　　其他含氮物質的干擾

　　通過凱氏定氮法的基本原理與操作步驟可發現，使用該方法檢測時，第一步消化的本質是將樣品中的氮元素全部轉化生成硫酸銨，即凱氏定氮法測量的是被測樣品中有機物中含有氮元素的總量，因此該辦法并無法消除樣品中其他有機物中含有的氮元素對測量結果的影響，如尿素、三聚氰胺等。當年三鹿公司使用的蛋白質檢測方法便為凱氏定氮法，最終未能檢測出原料中的三聚氰胺而導致食品安全事件。除去樣品中非蛋白質部分有機物中氮元素對整個測量的影響，要先去除非蛋白質中的氮元素再進行具體測量，或用其他方法測出非蛋白質中的氮含量，再用總氮含量減去該值再進行折算。