黃波教授團隊揭示CART療法引起炎癥因子風暴的機理

　　如何特異高效地殺死腫瘤細胞而不影響正常細胞的功能一直以來是人類醫學領域的研究熱點。而嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法作為通過改造病人自身免疫系統而實現特異性殺死癌癥細胞的一種免疫療法，為人類戰勝癌癥帶來勝利曙光。2017年，美國食品藥品監督管理局（FDA）已經批準了用于治療白血病和淋巴瘤的CAR-T療法，從而拯救了那些傳統療法無法治愈的癌癥患者。然而，研究人員發現在CAR-T的臨床的應用中，會伴有明顯副作用——炎癥因子風暴 (Cytokine release syndrome，CRS) 。而且CAR-T殺傷腫瘤細胞的效果越明顯，炎癥因子風暴（CRS）也越強烈，過強的炎癥反應反而會引起病人的死亡【1】。2019年，估計有37％～93％的淋巴瘤患者和77％～93％的白血病患者患有CRS。雖然已經有研究報道顯示，在CAR-T的治療中巨噬細胞是炎癥因子風暴的重要來源【2】，但是CAR-T療法是如何導致的炎癥因子風暴仍然不清楚，因而，也就缺少有效的干預手段。

　　2020年1月17日，中國醫學科學院基礎醫學研究所的黃波教授團隊在Science Immunology發表了最新研究成果Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome。研究展示了CAR-T細胞激活靶細胞Capase-3并活化gasdermin E GSDME誘導癌癥靶細胞發生細胞焦亡（pyroptosis）；進而同時釋出ATP、HMGB1等因子，這些因子激活巨噬細胞內的caspase-1-GSDMD和MAPK-NF B炎癥通路，進而引起炎癥因子風暴。

　　細胞凋亡（apotosis）和細胞壞死（necrosis）是兩種完全不同的細胞死亡方式。細胞凋亡是一種程序的死亡，死亡過程平和而相對干凈不會引起炎癥反應，而細胞壞死則發生的比較快，細胞裂解而死的同時還會釋放出炎癥因子，誘導產生炎癥反應。在本研究中，黃波教授團隊成員發現當CD19-CAR-T與白血病病人的癌細胞細胞共培養時，在顯微鏡下大部分癌細胞細胞變得腫大，并快速裂解，通過流式細胞技術檢測發現死亡的癌細胞呈現annexinV+/PI+雙陽性，這是典型的細胞壞死（necrosis）表型。

　　而細胞壞死（necrosis）包括MLKL介導的壞死性凋亡 (necroptosis) 和GSDMD或GSDME介導的細胞焦亡（pyroptosis）。下一步他們將CAR-T細胞和淋巴癌細胞進行共培養，實驗發現CD19-CAR-T細胞能夠有效地殺死Raji和NALM-6這兩種淋巴癌細胞，并且隨著作用時間的延長和CAR-T細胞數量的增加，癌細胞釋放的lactate dehydrogenase LDH也隨之增加，顯示癌細胞焦亡的增加。研究人員通過本團隊原先開發的基于AFM的成像技術，可以觀察到與CAR-T細胞接觸后的癌細胞的細胞膜上形成明顯的孔狀結構。隨后研究人員發現，來自病人的淋巴癌癥B細胞與CD19-CAR-T細胞共培養后，活化的c-Caspase3和活化的N-GSDME明顯增加。而敲除癌細胞Raji和NALM-6內的GSDME能夠抵御CAR-T細胞的殺傷作用。這些實驗結果證明CAR-T細胞能夠激活癌癥靶細胞內的caspase-3，切割GSDMD，誘導靶細胞發生細胞焦亡（pyroptosis）。

　　隨后的機制分析，研究人員發現抑制CAR-T細胞內的顆粒酶 B（granzyme B）合成和抑制負責其釋放的穿孔素的形成均能夠阻斷CD19-CAR-T細胞對Raji和NALM-6癌細胞的殺傷，證明顆粒酶B (granzme B) 對于CAR-T細胞引起的細胞焦亡發揮著重要作用。進一步實驗發現CD19-CAR-T能夠引起與其有高親和力的CD19-B16癌細胞內顆粒酶B的增加和癌細胞的焦亡，而不能引起與其有低親和力的vec-B16、HER2-B16癌細胞發生焦亡，從而證明CAR-T細胞與靶向癌細胞直接特異的高親和力對于CAR-T引發癌細胞的焦亡至關重要。

　　那CAR-T細胞誘導的靶細胞焦亡又是如何導致炎癥因子風暴的呢？研究成員通過一系列的實驗發現癌癥靶細胞焦亡時能夠釋放出大量的ATP、HMGB1等因子到周圍環境中，而這些因子作用到巨噬細胞并引起巨噬細胞內的caspase1-GSDMD和MAPK-NF B激活，進而釋放IL-1β、IL-6等炎癥分子，引起炎癥因子風暴。最后，研究人員通過小鼠模型證明抑制腫瘤細胞內的GSDMD或利用阻斷腫瘤細胞到巨噬細胞的ATP都能夠緩解CAR-T療法引起的體重減輕，持續發燒等炎癥因子風暴的癥狀并明顯延長小鼠的存活周期。

　　總結來說，這項研究通過CAR-T細胞與癌癥靶細胞的共培養等系列實驗，揭示了CAR-T療法激活癌細胞焦亡而激發細胞因子風暴的具體機理。這項研究為解決CAR-T療法的副作用提供了潛在的方法，為優化設計新一代更加安全高效的治療癌癥的CAR-T提供思路。