2.7.1從革蘭氏陰性菌中分離高質量RNA

大腸桿菌培養物或 藍細菌培養物

DEPC 處理的水終止緩沖液STET 裂解液酚氯仿3mol L 乙酸鈉緩沖液0.2mol L 和 l0 mmol L 氧釩核苷復合物氯化銫CsCl 塾層冰冷的無水乙醇乙醇

離心機超速離心機

一 材料與設備

1)100 ml 大腸桿菌培養物或 500 ml 藍細菌培養物。

2)DEPC 處理的水。

3) 終止緩沖液：200 mmol/LTris-Cl(pH8.0)，20 mmol/LEDTA，20 mmol/L 疊氮鈉,20 mmol/LATA(aurmtrkart〕oxylicadd，Sigma)。如果 RNA 要用來作引物延伸或用于 S1 核酸酶作圖. 就不要加 ATA; 緩沖液在棕色瓶屮于室溫保存。

4)STET 裂解液：8%(M/V) 蔗糖，5%(V/V)TritonX100.50 mmol/LEDTA,50 mmol/LTris-Cl(pH7.0)，用 DEPC 處理的母液配制，于 4℃ 保存。

5) 酚 [用 Tris-Cl(pH8,0) 平衡]。

6) 氯仿。

7)3mol/L 乙酸鈉緩沖液 pH(6.0)。

8)0.2mol/L 和 l0 mmol/L 氧釩核苷復合物

9) 酚：氯仿（1:1),

10) 氯化銫。

11)CsCl 塾層：5.7mol/LCsCl，100 mmol/LEDTA(pH7.0)

12) 冰冷的無水乙醇和 70% 乙醇。

13) 離心機，超速離心機。


二 操作方法

1) 培養 100 ml 大腸扦菌或 500 ml 藍細菌至對數生長期，加入 1/20 體積終止緩沖液, 置于冰上

2) 于 4℃5500 g 離心 5 min 收集細胞。用 2 mlSTET 裂解液重懸細胞，加入 lO0ul0.2mol/L 的氧釩核苷復合物，移入 15 min 聚內烯管中。

3) 加人 lml 酚，振蕩 lmin; 再加 lml 氯仿，振蕩 Imin。于 4℃10000 g 離心 10min，收集水相。

4) 加入 1/10 體積 3mol/L 乙酸鈉和 2 倍體積冰冷的無水乙醇，于 4℃10000 g 離心10min。用 2 ml0.2mol/L 氧釩核邗復合物溶液重溶沉淀。

5) 用酚：氯仿（1:1) 柚提 2 次，按步驟 4 重新沉淀。

6) 如用 BeckmanTLA-100.3 轉子：重溶沉淀于 2 mlDEPC 處理水中. 加 lg 固體CsCl 并便之完全溶解，取 2.25 ml 加在 13 mm×15 mm 聚碳酸酯超離心管中的 0.75 mlCsCl 墊層之上，干 20℃280OOOg 離心 1 h, 如用 BeckmanSW-41 轉子：重溶沉淀于 6 mlDEPC 處理水中，加入 4.5 g 固體 CsCl 并使之完全溶解，補加 DEPC 處理水至 9 ml. 并將其加在 14 mmX89 mmUlrradcar 超離心管中的 SmlCsCl 墊層之上，于 20°C150OOOg 離心 24 h

7) 用無菌巴斯德吸管小心地移去界面的 DNA 層，然后移去上層 CsCl 液，傾去殘余液體，作記號標記 RNA 沉淀的所在，用紙巾擦干離心管壁，沉淀用 0.36lDEPC 處理水重溶并移至 1.5 ml 的微量離心管中。離心完畢后勿將離心管長久放在轉子上, 應立即處理。

8) 加入 1/10 體積 3mol/L 乙酸鈉和 2.5 倍體積冰冷無水乙醇，于-70℃ 沉淀 20 min, 于用微量離心機高速離心 5 min，RNA 沉淀中加人入 4℃ 用微量離心機高速離心 5 min

9) 晾干沉淀，并溶解于 200ulDEPC 處理過的水，測 A260 和 A280 定量 RNA, 最后調節濃度至 20ul./ul. 于- 70℃ 長期保存或以乙醇沉淀的形式保存。