3分鐘讀懂環介導等溫擴增（LAMP）那些事兒

　　什么是LAMP？

　　環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人于2000年提出來的一種新的核酸擴增技術。針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下，可以在60-65℃溫度范圍內進行恒溫擴增。在擴增的初始階段，由于引物的延伸和初級擴增子的連續鏈置換，形成了啞鈴狀反應中間體，相較于PCR反應擴增機制更為復雜，但是卻大大縮短了擴增時間，15-60分鐘內即可實現109-1010核酸擴增，可以一步完成基因的擴增和檢測，已被廣泛地應用于病原微生物檢測和傳染性疾病診斷等領域。

　　LAMP的作用機制

　　LAMP 反應可分為復制起始、循環擴增，延伸三個階段（如下圖所示）。LAMP不同于PCR，它不需要通過熱變性來促進雙鏈DNA轉化為單鏈。在復制起始階段，由于雙鏈DNA在65°C條件下處于動態平衡穩定狀態，一條LAMP引物可以與雙鏈靶基因的互補序列結合，在鏈置換DNA聚合酶作用下，啟動DNA的合成，最終形成啞鈴狀互補鏈，即為進入循環擴增的起始原料。繼而通過連續鏈置換進入循環擴增階段，最后延伸階段，擴增的最后產物是具有不同個莖環結構、多環花椰菜樣結構的DNA的混合物，且產物DNA為擴增靶序列的交替反向重復序列。

圖1. LAMP 反應過程圖。F1、F2、F3是靶基因上約20 bp長的序列片段，B1、B2、B3則是位于互補鏈上長度約20 bp的序列，F1c和B1c分別是F1和B1的互補區。

　　LAMP與PCR擴增區別

　　什么是RT-LAMP？

　　逆轉錄環介導等溫擴增法(RT-LAMP) 將環介導等溫擴增(LAMP)與逆轉錄反應相結合，直接檢測出RNA的方法，當它與反應混合物中的pH指示劑耦合時，可以通過顏色變化獲得檢測結果。在新冠檢測應用上，可以在60-65°C等溫條件下，一步進行RNA逆轉錄和核酸擴增過程，30 min即可得到結果，同時檢測ORF1ab基因、E基因和N基因。由于ORF1ab基因具有很強的特異性，N基因具有很強的敏感性，這種方法可以保證病毒檢測的靈敏性和特異性。

　　RT-LAMP與RT-qPCR的區別？

★LAMP引物設計

　　LAMP的特點是使用4或6種不同的引物，專門設計用于識別目標基因的6個不同區域，包括3'端的F3c、F2c和F1c區域和5'端的B1、B2和B3區域，如圖1所示。引物設計包括：

　　正向內引物（Forward Inner Primer, FIP）：由F2區和F1c區域組成，F2區與靶基因3’端的F2c區域互補，F1c區與靶基因5’端的F1c區域序列相同；

　　正向外引物（Forward Outer Primer , FOP/ F3 ）：由F3區組成，與靶基因的F3c區域互補；

　　反向內引物（ Backward Inner Primer , BIP ）：由B1c和B2區域組成，B2區與靶基因3’端的B2c區域互補，B1c區域與靶基因5’端的B1c區域序列相同；

　　反向外引物（Backward Outer Primer, BOP/B3）：由B3區域組成，與靶基因的B3c區域互補。