RealtimePCRmRNA定量實驗路線選擇F&Q
本期專文要來跟大家討論的話題是核糖核酸(RNA)的萃取，看到這里各位心中可能已經起了疑問: RNA 萃取不是很簡單嗎?只要照著標準步驟操作，加一加試劑就完成了，有必要大費周章特地開篇幅來談這件事嗎?其實越簡單的東西遇到困難時就越難解，各位看倌就請耐著性子，聽我們娓娓道來。 Lab 的經驗和客戶的難題 以華聯基因體實驗室的長期以來承接客戶RNA檢體的經驗來說，我們經常遇到的問題是(1)RNA的總量不夠，(2)RNA有嚴重的鹽類污染，(3)RNA有嚴重的有機溶劑污染，(4)DNA污染及(5)樣品降解嚴重(圖一圖二)。前四項問題都還好解決，只需要再次萃取或進行純化即可解決，但是樣品降解就較為棘手，常常因重新準備檢體一來一往，耗掉不少心力和時間，最后也拿不到好的結果。 客戶經常會問為什么執行芯片實驗會如此要求RNA質量呢?而其他的檢測方法如實時定量聚合連鎖反應(Real-time Quantitative Poly......閱讀全文
Real－time－PCR－mRNA－定量實驗路線選擇FQ
本期專文要來跟大家討論的話題是核糖核酸(RNA)的萃取，看到這里各位心中可能已經起了疑問: RNA 萃取不是很簡單嗎?只要照著標準步驟操作，加一加試劑就完成了，有必要大費周章特地開篇幅來談這件事嗎?其實越簡單的東西遇到困難時就越難解，各位看倌就請耐著性子，聽我們娓娓道來。 Lab 的經驗和
Real－time－PCR－mRNA－定量實驗路線選擇FQ
問題一：Real time PCR mRNA的相對定量和絕對定量的選擇；測定mRNA, 一般采用相對定量，因為絕對定量，標準品的制備和定量是有難度的，具體可以參考這篇文獻：http://www.biotnt.com/news/news_105.htm；“Analysis of Relative Ge
實時熒光定量PCR（RealTime－PCR）實驗流程
一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉錄)不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-Time PCR對RNA樣品的質量要求較高，所以，正式實驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總rna的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂;取2u
實時定量PCR（Realtime－quantitative－PCR）
mRNA表達的研究 微小殘留病變的檢測 腫瘤耐藥基因表達的研究 病毒感染的定量監測Vs普通PCR，RT-PCR的優勢 采用封閉的檢測模式，因此擴增產物導致污染的可能性比普通PCR要小得多 。 擴增產物的檢測在PCR擴增過程中同時進行，并且數據的采集、分析全部由 儀器 自動完成，因此整個檢測所 需的時
RealTime－PCR實驗流程
實驗試劑Total RNA Kit ：Omega：(Cat.No．R6834)First Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia(Cat.No．C0210A)2xAllinOneTMQ-PCRMix：GeneCopoeia（cat.No．D0101A)Primer
Realtime－PCR
實驗概要The ?exponential amplification via reverse transcription polymerase chain ?reaction provides for a highly sensitive technique in which a very low
實時熒光定量PCR（Realtime－PCR，QPCR，熒光定量）分類以...
實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）分類以及實驗步驟介紹實時熒光定量PCR（Real-time?PCR，QPCR，熒光定量）技術（Real-time?quantitative?PCR），是指在（QPCR，熒光定量）反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號積累實時監測整個（
RealTime－or－Kinetic－PCR
The DNA Facility houses the “real-time” or kinetic PCR instrument, the Applied Biosystems Model 7700 sequence detection system (the TaqMan instrument)
Real－Time－PCR－Primer－Sets
Real Time PCR Primer SetsNOW OVER 300 PRIMER SETS!!!UPDATED: NOVEMBER 10th, 2003Quantitative RT-PCR is an important step for the validation of express
Realtime－PCR實驗注意事項
Real-time PCR實驗注意事項實驗中的一些好習慣加入試劑之前,把它混勻一下,以免放置時間長了濃度不均移液槍用完之后要歸到zui大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性一定要記著關水浴箱，切記切記多和大家討論，同時多關注別人討論的經驗，這幾乎是zui快提高的捷徑了所有的試劑都自己配，出了問題才好
Realtime－PCR實驗注意事項
實驗中的一些好習慣加入試劑之前,把它混勻一下,以免放置時間長了濃度不均移液槍用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性一定要記著關水浴箱，切記切記多和大家討論，同時多關注別人討論的經驗，這幾乎是最快提高的捷徑了所有的試劑都自己配，出了問題才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器
實時熒光定量PCR（Quantitative－Realtime－PCR－，qPCR）技術介紹
熒光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。熒光定量PCR的發展史是一部ABI、羅氏和伯樂等巨頭的蕩氣回腸的斗爭史，感興趣的可以去查查。該技術是目前最成熟，使用最廣泛的半定量PCR技術。? ??熒光染料法（SYBR
Real－Time－PCR—Cycleave－PCR法原理
■ CycleavePCR法原理 CycleavePCR法是由RNA和DNA構成的雜合Cycling 探針與RNase H組合使用的高靈敏度檢測方法，能夠高效率地檢出目的基因。Cycling 探針內部夾有RNA部分，5′端標記熒光物質，3′端標記淬滅物質，當探針處于完整狀態時，由于熒光淬滅作
做real－time－pcr，逆轉錄引物怎么選擇
顯然是選random primer更好，其實說明書是有寫的啦，原因是RT-PCR逆轉錄是要得到一個所有的RNA的cDNA庫，然后再P出你要的“幾個基因”，所以不是每個基因的mRNA都是有polyA的，很多都是沒有的，microRNA，piRNA，很多都沒有哦，所以如果你用oligo dT引物，就自然
Realtime－PCR實驗心得和RNA提取心得
并不是所有的實驗都可以做real－time的，技術路線要選好當你的基因表達量少或有些不表達具體就是做普通pcr跑膠條帶比較弱，不是很亮的情況下個人覺得最好不要選擇real，不容易做好，特別是融解曲線用sbgr green染料做的話，引物設計時擴增片斷最好小于250bp，太長了不好擴預實驗先rt－pc
real－time－PCR實驗為什么要使用內參基因
這個是根據定量PCR算法決定的，如果是相對定量，就需要內參，內參主要是使樣品均一化，你做實驗的時候，可能提取RNA時所用的樣品是相同的，反轉錄時所用的mRNA的量是相同的，做定量PCR時所加的cDNA量也是相同的。但是你的樣品是新長的部分，還是老的部分？反轉錄時是加相同的體積還是相同打質量，這些對結
Real－time－PCR－的標記方法介紹
?Real time PCR 的標記方法一般包括以下幾類：熒光染料嵌合法（SYBR Green I）和熒光探針法(Taqman探針）和分子信標法。? ? SYBR Green I 法? ??? ? Taqman探針法? ??? ??分子信標法? ??
無需提取－直接檢測——Real－Time－PCR
針對客戶對實驗快速、高效率的需求，Takara不斷努力探索。2019年6月，Takara推出無需從糞便、血液、細胞等樣本中提取RNA，即可直接檢測樣本中目的基因的One Step Real Time PCR Premix試劑【PrimeDirect? Probe RT-qPCR Mix】（Cod
Real－time－PCR試劑質量的評價
臨床使用PCR定量檢測核酸，由于手工操作多、影響因素多，質量控制比較困難，在增強操作能力和儀器設備的基礎上，選擇好的PCR試劑是保證檢測質量非常重要的關鍵。一、通過實時熒光PCR擴增曲線評價【擴增曲線圖解讀】實時熒光PCR由于每個循環要監測熒光信號值，因此都有擬合好的擴增曲線，通過擴增曲線可以很直觀
realtime－PCR－數據分析
無論所使用的real-time PCR是何種型號，正確的數據分析對于獲得有效的實驗結果都是至關重要的。這里介紹有關real-time PCR數據分析的知識。?在討論基本分析過程之前，先介紹如何設計一個好的實驗。如果你是自己設計的引物和探針，那有助于下一步的工作。但是在有些情況下，人們使用出版文獻上的
realtime－PCR體系的優化
實時定量PCR以其精確、快速、方便，越來越多的應用在科研、臨床及檢驗檢疫的各個領域。但是定量PCR是對精確性要求很高的實驗，實驗的條件對實驗結果的影響非常大。在此談談體系優化的問題，希望對做相關試驗研究的朋友有所幫助。1、基本參數的優化：1）MgCl2的濃度：在PCR反應中，MgCl2的濃度對酶的活
Realtime－PCR－基礎知識
理論基礎?聚合酶鏈式反應作為一種革命性的方法在生物學研究的歷史中占據了重要的地位。以此為基礎發展出包括real-time PCR在內的多項應用技術。自誕生后real-time PCR技術持續發展，從簡單的增擴到整個PCR過程，real-time PCR表現出比PCR更敏感、更明確的定量分析特
RTPCR、QPCR、Realtime－PCR、realtime－RTPCR你真的區分的開嗎？
多少同學能將 RT-PCR、Realtime-PCR、QPCR區分開？有多少同學還在犯暈？今兒這貼，師兄就帶你區分區分，撥開那扇 PCR 迷霧。什么是?RT-PCR？RT-PCR就是逆轉錄 PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉錄PCR(reverse transcr
realtime－PCR－常用儀器和探針
?1.SYBR Green I：一種DNA結合染料，能非特異性地與雙鏈DNA結合，結合后發出熒光，價格便宜，但因無特異性，易受到非特異性擴增和引物二聚體地的影響，是定量結果不可靠。可用融解曲線分析區分特異性和非特異性擴增，引物的設計和反應條件的優化對消除非特異性熒光有很大幫助。2.Taqman探針：
realtime－PCR－常用儀器和探針
SYBR Green I：一種DNA結合染料，能非特異性地與雙鏈DNA結合，結合后發出熒光，價格便宜，但因無特異性，易受到非特異性擴增和引物二聚體地的影響，是定量結果不可靠。可用融解曲線分析區分特異性和非特異性擴增，引物的設計和反應條件的優化對消除非特異性熒光有很大幫助。 2.Taqman探針：
熒光染料Real－Time－PCR的引物設計
引物的設計相對于普通的PCR來說，還是有一些更為嚴格的要求：1、引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；2、引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；3、引物一般要設計在目的基因中跨內含子的位置，這樣可以避免在存在DNA污染的情況下，對目的片斷的額外的擴增；4、對于定量PCR來說，特別
REALTIME－PCR－WITH－SYBR－GREEN－I－PROTOCOL
1、反應體系 25ulCocktail 20 ul: Primer FP 1 ul + Primer RP 1u + 2 * SYBR GREEN I MIX 12.5 + H2O 5.5 ul cDNA 5 ul2、Primer 濃度，需要摸索，從200nM到700nm等，設置不同濃度。3、每個引
如何分析real－time－PCR的數據結果
學習做Realtime PCR, 實驗結果是出來了，得到的內參、目的基因的Ct 值在15-25 之間，熔融曲線基本上也是單峰，但不太會處理這個結果，對著數據發愁。。。不同的處理方法得到不同的結果。。。做的是相對定量，SYBR Green, 選用2^（-△ △ Ct）法內參基因：對照組1、對照組2
如何分析real－time－PCR的數據結果
學習做Realtime PCR, 實驗結果是出來了,得到的內參、目的基因的Ct 值在15-25 之間,熔融曲線基本上也是單峰,但不太會處理這個結果,對著數據發愁.不同的處理方法得到不同的結果.做的是相對定量,SYBR Green, 選用2^（-△ △ Ct）法內參基因：對照組1、對照組2、對照組3實
Realtime－PCR與RTPCR的區別
實時熒光定量PCR原理所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。1．內標在傳統定量中的作用由于傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重