4大基因測序技術在無創性產前檢測中的應用

　　近年來，通過高通量測序技術檢測孕婦外周血中游離胎兒DNA（cfDNA）篩查胎兒染色體多倍體異常的無創性產前檢測( noninvasive prenatal testing， NIPT)技術正越來越多地用于臨床，其具有安全性、高效性及準確率高的特點，正在給產前診斷技術帶來革命性的變化。NIPT技術可以3種途徑介入產前檢查:替代血清學篩查、替代有創產前產前診斷、作為血清學篩查與有創診斷的中間步驟。臨床期待NIPT技術能夠替代現行的孕婦血清學篩查與羊水胎兒脫落細胞染色體分析等有創產前診斷技術，國內外學者對此均陸續開展了相關的研究。為此，小編將對NIPT技術及基因測序技術在臨床應用進行匯總。

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什么是NIPT技

　　在臨床上，NIPT技術相對于羊膜腔穿刺、絨毛取樣、臍血穿刺而言，不需要經“有創穿刺”即可獲得胎兒遺傳物質進行相關的檢測分析。雖然，早在1997年已經證實孕婦外周血中存在 cfDNA，且其含量與代謝半衰期等特點均適合用于產前檢查，但直到高通量測序技術的出現才使得基于 cfDNA的NIPT技術的臨床應用成為可能。孕婦血漿樣品中可檢測到母源性和胎源性的DNA分子，如果母體健康正常，基因組是整倍體，孕婦血漿DNA分子拷貝數的非整倍體偏差，一定是由胎兒染色體異常所致。采用高通量測序技術通過對孕婦外周血中各條染色體對應 cfDNA拷貝數的檢測，計算來源于21號、18號、13號等染色體的 cfDNA是否增加，以篩查胎兒是否為唐氏綜合征等。

　　當前，臨床NIPT技術主要包括鳥槍法大規模平行測序技術(s-MPS)、靶向的大規模平行測序技術(t-MPS)以及基于單核苷酸多態性的NIPT技術。其中，s-MPS可用于所有非整倍體的檢測，對于非嵌合的21三體、18三體、13三體的檢測有效性已經得到驗證。t-MPS主要針對21號染色體、18號染色體、13號染色體進行選擇性擴增，計算目標染色體是否相對過量。單核苷酸多態性的NIPT技術通過測序分析擴增產物，根據SNP在色體的位置以及存在重組的可能性，計算出胎兒是正常體、非整倍體或三倍體(21三體、18三體、13三體以及性色體異常)的最大似然比。該技術可以驗證胎兒染色體同源的區域，因此，可以檢出同源或者單親二倍體。

基因檢測技術在NIPT中的應用

　　全基因組擴增技術(WGA)

　　WGA是一種對全部基因組序列進行非選擇性、均勻擴增的技術，可以在保持基因組原貌的基礎上最大限度地增加基因組DNA的量。該技術可對痕量DNA(檢測靈敏度可達5pg)進行擴增，為后續的基因組分析提供足量的模板。常用的WGA主要分兩類:一類是以PCR為基礎，如使用變性寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、引物延伸預擴增PCR(PEPPCR)；另一類是不以PCR為基礎，如多重置換擴增(MDA)。由于以PCR為基礎的WGA易產生非特異性的擴增，位點覆蓋率不完全，且DNA片段長度一般小于1kb，使其應用受到限制

　　比較基因組雜交(CGH)

　　CGH基本原理是分別用不同的熒光標記體系標記來自待檢組織和正常組織的全基因組DNA(分別稱為測試DNA和參照DNA)，各取等量標記產物制備成混合探針，與足夠量的同一種屬來源的Cot-IDNA先進行預雜交以封閉基因組上的重復序列，然后與正常中期分裂相進行染色體原位雜交。測試DNA探針和參照DNA探針競爭性地與染色體上的靶序列雜交，經計算機軟件分析，將染色體上每一像素上測試DNA參照DNA熒光強度的差異進行計算，以研究測試DNA拷貝數的增多或缺失。該技術不需細胞培養，一次雜交實驗即可在整條染色體或染色體區帶水平對不同基因組間DNA序列拷貝數的差異進行檢測并定位。為了解決傳統的CGH雜交時間太長，研究人員將基因芯片和CGH結合，形成新技術-微陣列比較基因組雜交技術( microarray-CGH，又稱 array-CGH)。其原理與CGH相似，不同之處是用微陣列(即基因芯片)代替了中期分裂相，熒光標記的測試DNA探針和參照DNA探針競爭性地與微陣列中的短片段靶序列雜交，這樣就縮短了檢測時間，達到靈敏快速、自動化在臨床遺傳學診斷中有較好的應用前景。

　　在個案研究中，研究人員利用 array-CGH發現了許多新缺失，如帶有12122123.2間隙式缺失的畸形胚胎、新12p-三體綜合征以及帶有15q15.3-21.3間隙式缺失的短股骨分離畸形胚胎的。Gruchy等收集了38例高危孕婦(其中某些存在胎兒宮內發育遲緩和/或胎兒畸形)已細胞培養過的羊水細胞DNA和羊水 CfDNA進行arrayCGH診斷，結果顯示直接提取于羊水的 cfDNA得到了很好的結果(8%的畸形確診率，同時也經傳統核型分析驗證過)。已培養的羊水細胞DNA，直接提取cfDNA的優勢在于可在妊娠晚期進行，而羊水細胞培養則不行。

　　第二代測序技術(NGS)

　　NGS為新一代測序技術，其主要原理是:①每個位點以單分子原DNA模板合成新DNA同時測序，在此過程中添加不同種dNTP會釋放出不同的熒光；②巨大數量位點上各DNA短片段測序以陣列方式同時平行進行。通過測定每種分子序列的頻率定量地反應其在原DNA庫中的頻率，同時測出的序列準確、定性地反應其在原DNA庫中的序列，如有背景信號造成序列不符很容易在結果中濾除。

　　由于NGS的高效性及高準確率，研究人員將其作為無創產前基因檢測技術，直接取材于孕婦外周血中存在的 CfDNA，應用于胎兒染色體非整倍體的臨床檢測。Chiu等人提取了753例孕婦的外周血cf核酸，并用二代測序技術進行測序，準確診斷出86例孕婦懷有21三體的胎兒。21體的陽性預測率為96.6%，陰性預測率為100%，靈敏度達到100%，特異性達到97.9%。 Palomaki等用染色體核型分析方法和二代測序方法分別對212例已證實懷有21三體胎兒的孕婦和1484例正常孕婦進行cf核酸檢測。結果顯示，21三體的檢出率為98.6%，假陽性率僅為0.2%。除了檢測21三體以外，這項技術還可用于鑒定18三體和13三體，檢出率高達100%和91.7%7。Dan等可募集到11105例孕婦，利用二代測序進行了胎兒21三體和18三體綜合征的檢測，結果共檢測出190例(1.17%)染色體數目異常患者，包括143例21三體綜合征患者以及47例18三體綜合征患者。通過對陽性結果進行核型分析以及胎兒出生后的隨訪，研究人員發現所檢測出的21三體和18三體綜合征病例中均有一例假陽性；而在對所有的陰性病例及胎兒出生后的隨訪中發現沒有出現假陰性。因此，本次臨床結果顯示二代測序無創產前基因檢測技術的敏感度達到100%，準確度達到99.96%。

基因測序與單基因病診斷

　　除了臨床中檢測21三體、18三體、13三體以外，基因測序繼續在無創產前診斷單基因病（NIPD）中也發揮重要作用。在常色體顯性遺傳病單基因疾病診斷中，軟骨發育不全( achondroplasia)是第一個進入臨床實踐的單基因遺傳病之一，是以肢體短小為特征的常染色體顯性遺傳性疾病，98%的致病基因位于4號染色體短臂FGFR3基因上的c，1138G>A突變，部分為新發突變，與父親高齡所致精子缺陷有關。最早的基于母血胎兒游離DNA無創產前診斷軟骨發育不全的文獻由日本學者 Saito H于2000年報道。除了在軟骨發育不全疾病檢測外，NIPD還在其他常色體顯性遺傳病如強直性肌營養不良( myotonic dystrophy)、致死性體( thanatophoric dysplasia)、守廷頓病( Huntington disease)等，并且這些驗證實驗均取得成功。

　　常色體隱性遺傳病單基因疾病診斷中，先天性腎上腺皮質增生( congenital adrenal hyperplasia，CAH)是使用NIPD檢測的常見疾病之一。先天性腎上腺皮質增生是由于6號染色體上編碼21痙化酶的CYP21基因突變導致皮質激素合異常，造成突變純合子女性胎兒外生殖器男性化。傳統的毛穿刺術最早于孕11周進行，而NIPD最早可于6周診斷，早期確定受累胎兒可以免正常胎兒接受不必要的藥物治療，減少用藥的副作用。此外，囊性纖維化( cystic fibrosis，CF)、β-地中海貧血等也是利用NIPD獲得驗證結果的疾病之一。

展望

　　NIPT具有較高的敏感性和特異性，但其與傳統的染色體核型分析技術之間存在不一致的情況。目前,染色體核型分析技術為產前診斷的金標準,NIPT檢測陽性結果須經有創產前診斷方法證實。隨著NIPT不斷發展，結合第三代乃至第四代基因測序技術，NIPT在不久的將來將應用于更多臨床疾病的檢測和研究。