基因的重組連接技術
DNA酶切片段的連接是分子生物學實驗中又一關鍵技術，該技術是基因重組，基因改造的重要中間環節。兩DNA片段相鄰的5'磷酸和3'羥基間可由連接酶催化形成磷酸二酯鍵，這個連接反應在體外一般都有大腸桿菌DNA聯接酶和T4DNA聯接酶催化，但分子生物學實驗中主要采用T4DNA聯接酶，因該酶在正常條件下，即能完成連接反應。在分子生物學實驗中連接酶主要用于1)基因重組中載體與外源基因的連接；2) 接頭與DNA片斷的連接，這種連接一般發生在文庫構建、分子標記的AFLP及差異表達的研究等中。連接反應可在溶液中進行也可在瓊脂塊中進行。本課程中在AFLP、文庫構建、PCR片斷的克隆等中均有連接的內容，在本部分僅以重組克隆為目的介紹相應的連接類型。在基因重組克隆中外源DNA與載體的連接是承上啟下的一步操作，根據連接片斷末端類型不同，連接方式有粘端連接、平端連接等和平粘端連接及單堿基配對的T－載體連接。其中粘端連接的效率最高，粘......閱讀全文
基因的重組連接技術
DNA酶切片段的連接是分子生物學實驗中又一關鍵技術，該技術是基因重組，基因改造的重要中間環節。兩DNA片段相鄰的5'磷酸和3'羥基間可由連接酶催化形成磷酸二酯鍵，這個連接反應在體外一般都有大腸桿菌DNA聯接酶和T4DNA聯接酶催化，但分子生物學實驗中主要采用T4DNA聯接酶，因該酶在
DNA重組技術－連接
實驗概要? ? ? ? 體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。實驗原理? ? 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段， ?然后體外使
DNA的重組連接
目的：了解T4DNA連接酶的幾種生物學功能及用途；學習在T4DNA連接酶的作用下，載體與目的基因的幾種不同的連接方式以及在標準的連接反應體系中，質粒載體和插入的外源DNA的比率關系和各自的用量；掌握用Pmd18-Tvector與PCR產物進行T-A克隆的機理及其應用。原理：外源DNA片段和線狀質粒載
DNA重組技術：酶切、連接
實驗原理: DNA重組技術是用內切酶分別將載體和外源DNA切開，經分離純化后，用鏈接酶將其連接，構成新的DNA分子。限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。 5’…G↓A
重組質粒的連接、轉化及篩選
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實
重組質粒的連接、轉化及篩選
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可
重組質粒的連接、轉化及篩選
實驗材料 外源DNA 片段試劑、試劑盒 連接反應緩沖液T4 DNA 連接酶X-gal儲液IPTG儲液麥康凱選擇性培養基儀器、耗材 恒溫搖床臺式高速離心機恒溫水浴鍋電泳裝置電熱恒溫培養箱電泳儀移液槍eppendorf管
重組質粒的連接、轉化及篩選
重組質粒的連接、轉化及篩選主要用于獲得含有目的基因連接的重組子。實驗方法原理用特定的限制性內切酶切割載體DNA和外源DNA片段并進行純化，于體外使兩者相連接(若用T-載體，可直接用純化的PCR產物進行連接)，轉化宿主細菌后，利用藍白斑篩選原理對重組子進行挑選。由于載體上帶有Amp'和lacZ
重組質粒(dna recombinant plasmid)的連接
質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA 片段( ＜10kb) 且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質粒轉化細菌，即可完成。但在實際工作中，
重組質粒的連接、轉化及篩選
材料、設備及試劑 一、 材料 外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知; 載體DNA: T-vector(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。 二、 設備 恒溫搖床，臺式高速離心機，恒