CRISPR：讓寨卡病毒無所遁形

近日，一種快速檢測寨卡病毒的試紙誕生，它的出現或許能夠降低小頭癥嬰兒的出生率。這種神奇的方法來自CRISPR技術。這個自2013年以來風靡世界的基因編輯技術正在生物醫學研究領域引起一場巨變。

寨卡病毒肆虐全球，為了對抗它，科學家一邊積極尋找預防的方法，一邊也在開發快速檢測的方法。近日，一個由美國哈佛大學維斯生物啟發工程研究所合成生物學家James Collins博士領導的國際合作小組開發出一種低成本的基于試紙的快速診斷系統，該系統能夠毒株特異性地檢測寨卡病毒，而且它可能很快被用來在現場篩查血液、尿液或唾液樣品。相關研究結果于2016年5月6日在線發表在Cell期刊上。

這種試紙的靈感誕生自2014年埃博拉病毒暴發期間，James Collins團隊發現埃博拉病毒可以被一種特異性RNA標記。之后，他們又發現這種特異性RNA不僅能夠標記埃博拉病毒的遺傳特征序列，而且能夠標記包括寨卡病毒、SARS冠狀病毒、麻疹病毒、流感病毒、丙肝病毒和西尼羅河病毒在內的其他RNA病毒的遺傳特征序列。研究人員認為，這種方法有朝一日能夠用于在現場鑒定血液、尿液或唾液樣品中的病毒。

這種神奇的方法就是CRISPR/Cas9技術。為了讓新的試紙可以有效地檢測在血液、尿液和唾液中存在的極低濃度的病毒，Collins團隊設計一種簡單的模塊化工作流程，由擴增、寨卡病毒檢測和CRISPR/Cas9輔助的毒株鑒別三個步驟組成。

作為一種源自細菌免疫系統的基因編輯機制，CRISPR/Cas9系統可以識別寨卡病毒基因組中特異的核酸序列。“寨卡病毒是一種RNA病毒，該方法通過RNA的體外反轉錄和擴增得到相同序列的DNA，這些DNA便可以被CRISPR系統識別。”中國科學院生物物理研究所研究員劉光慧在接受《中國科學報》記者采訪時解釋說。

CRISPR是何方神圣？

CRISPR是“規律成簇間隔短回文重復”的英文縮寫，來自細菌體內，肩負著細菌免疫的“重任”。它驅逐外來DNA的過程并不復雜。首先，CRISPR把病毒DNA的片段整合進細菌自己的基因組，然后轉錄出RNA。之后，CRISPR RNA就能通過互補序列結合病毒基因組，并利用細菌表達CRISPR相關核酸酶，也就是Cas酶，切割病毒的DNA，阻止病毒完成其功能。在完成了對外來病毒快速精確打擊后，細菌還可以將整合過的基因組的序列傳遞給下一代細菌，就像人類的遺傳系統，讓下一代免受相同病毒的騷擾。

其中，Cas酶起到了至關重要的作用，為了更好地利用這一技術工具，不少實驗室解析了這種酶的精確分子機制，探索其如何靶向作用于DNA的。2014年，來自美國倫斯伯克利國家實驗室和加州大學伯克利分校的研究人員，解析了這一叫作Cas9的細菌酶在病毒感染過程中是如何在RNA序列的引導下識別和降解外源DNA，并且實現了在動物和植物細胞中的靶向遺傳修飾。通過結合單分子成像和大量的生化試驗，該研究小組證實Cas9的基因組編輯能力是通過稱作為“PAM”的短DNA序列來實現的。

南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院副院長、教授陳曉光在接受《中國科學報》記者采訪時表示，CRISPR/CAS9是2013年以來風靡世界的基因編輯技術，但將該技術應用于病原體的檢測，則才見于2016年5月6日在線發表在Cell期刊上Collins等的研究報道，“因此CRISPR檢測方法是一種全新的、劃時代的病原檢測新技術，將對病原檢測/傳染病診斷帶來革命性的影響”。

下一個諾貝爾獎？

從1953年沃森和克里克發現DNA雙螺旋結構到2000年人類基因組計劃完成，人類一直處于對基因組的了解和認知階段，而CRISPR技術的快速發展和廣泛普及實現了從認識基因組到主動操控基因組的時代跨越。

可以說，CRISPR的發現將為人類提供了認識和實現病毒免疫的捷徑，而且它正在生物醫學研究領域引起一場巨變。因為，相比較其他基因編輯手段，CRISPR使用起來廉價、迅速且簡單。早期實驗室發現的“鋅指核酸酶”需要花費5000多美元才能訂購到，而且它們很難進行基因改造。但是CRISPR卻大不相同：它依靠一種利用引導性RNA分子將其導向目標DNA，隨后被稱為Cas9的酶對目標DNA進行切割，從而實現目標基因序列的缺失或插入想要的序列。通常，研究人員需要訂購的只是RNA片段，全部花費只有30美元。

“CRISPR系統的優勢在于其操作簡便、低價高效。CRISPR系統的出現大大降低了基因組編輯的技術門檻，為動植物的精準基因操作提供了強有力的技術支持，使得科研界全面進入高速高質高量的基因編輯時代。同時，為開發基于基因編輯的人類疾病治療手段提供了無限可能性。”劉光慧總結道。

這讓CRISPR很快席卷全球實驗室。研究人員希望利用它調整人類基因以消除疾病，創造生命力更加頑強的植物，并且消滅病原體。

去年，倫敦帝國學院的研究團隊通過基因編輯使瘧蚊喪失生育能力，并將這一性狀傳播到群體中。這項發表的研究論文提到，岡比亞按蚊是撒哈拉以南非洲危險瘧原蟲的主要攜帶者。研究人員對岡比亞按蚊進行了遺傳改造，讓它們攜帶了一種破壞雌蚊子卵子生成的改造基因。基因驅動讓這個基因加速傳遞給蚊子后代，進而傳播至整個種群。

應用前景亟待開發

既然CRISPR可以檢測出寨卡病毒，那么是否可以同理應用到其他病毒呢？“目前Collins等發明的檢測體系主要針對寨卡病毒，但稍加調整該體系理論上可以用于幾乎所有的RNA病毒，若進一步與韓春雨等的發明相結合，還可能用于DNA病毒的檢測。因此，該檢測體系的應用前景非常廣闊！”陳曉光認為。

不過，劉光慧進一步指出：“雖然理論上CRISPR檢測寨卡病毒的方式能夠被復制到其他病毒的檢驗中，但關鍵是能否從待測病毒基因組中找到專屬特異的核酸序列，從而最大可能地排除非特異識別導致的假陽性。”而且，目前Collins研究中所用的病例標本只是一例感染寨卡病毒的猴，真正要從實驗室走向實際應用，還需要大量的實際樣本來檢驗。“畢竟，實驗室研究與臨床和現場的檢測還有許多的不同。”陳曉光補充道，“還需要解決的尚有CRISPR/CAS9技術常見的‘脫靶’效應，如果這個問題得不到妥善解決，應用到人體CRISPR/CAS9就可能在RNA/DNA上亂‘切’，從而造成許多意想不到的‘副作用’。”