DNA微陣列技術介紹及其應用

DNA微陣列技術（microarray）指在固體表面（玻璃片或尼龍膜）上固定成千上萬DNA克隆片段，人工合成的寡核苷酸片段，用熒光或其他標記的mRNA,cDNA或基因組DNA探針進行雜交，從而同時快速檢測多個基因表達狀況或發現新基因，快速檢測DNA序列突變，繪制SNP遺傳連鎖圖，進行DNA序列分析等的一種新技術，其基本原理是基于Southern雜交或斑點雜交技術。將DNA 微陣列稱為基因芯片實際上是不確切的。 生物芯片 (bioship) 屬于分子生物電子學范疇，只采用DNA或蛋白質等生物高分子為骨架制成大規模集成電路，用于研制第六代智能計算機。

DNA 微陣列有兩種基本形式，即點樣型DNA 微陣列和原位合成型DNA 微陣列。

點樣型DNA 微陣列，通過PCR擴增的上萬個DNA克隆，或常規合成的寡合苷酸被點樣固定在一定固體表面（玻璃片，尼龍膜），用一組標記探針單獨或混合處理檢測。

制備方法：采用常規技術制備DNA，用點樣儀自動點樣在玻璃片上。

1.制備DNA片段：采用特異引物從各個克隆進行PCR擴增或將基因組DNA克隆到通用載體，然后純化后重懸浮于3*SSC，使終濃度為0.5μg/μl.

2.微陣列制作：玻璃片清洗，包被多聚賴氨酸（35ml 多聚賴氨酸，35ml PBS,280ml ddH2O)，雙蒸水沖洗，干燥。用微陣列儀點樣，每種樣品放5nl，用介層連接確定其互補序列。

制備方法：可改裝一臺半導體光印刷儀，采用光導向結合化學原理合成各種寡核苷酸探針。

1.玻璃片清洗后包被一層多聚賴氨酸。

2.在玻璃片上每個一定間距連接上帶有光不穩定保護基的羥基。

3.UV照射，通過光印刷儀的遮蓋膜使UV只穿過特定微孔射向玻璃片，將孔下的光不穩定保護基除去，產生自由羥基。

4.加入5’端帶光不穩定保護基的磷酰胺堿基與自由羥基連接。

5.使遮蓋膜微孔對準鄰側另一光不穩定保護基，重復4.5.依次有序進行，第一層堿基連接完畢后再進行第二層第三層.......。核苷酸探針的排列組成必須嚴格有序。

靶DNA與微陣列雜交及熒光標記檢測：在檢測靶基因不同表達水平時，常用一組不同熒光標記的mRNA和cDNA探針進行雜交。探針與微陣列在65度雜交16小時，依次用0.5*SSC,0.01%SDS,0.006*SSC在室溫下洗5min,除去未結合探針。然后用連接電腦的倒置掃描共聚焦顯微鏡閱讀微陣列，掃描和資料分析。一般采用分析紅色和綠色熒光雜交強度和比例的軟件分析。

DNA微陣列技術的應用

一，檢測基因表達水平及識別基因序列。Schena等1996年用擬南芥光調基因微陣列，以不同器官中的mRNA為探針，檢測其基因表達水平，結果表明葉mRNA的表達水平是根的500倍。Shelon等1996年將釀酒酵母基因組DNA克隆制成微陣列，用6條最大染色體和10條最小染色體DNA探針分別標記上紅，綠熒光標記進行雜交檢測，結果表明95%的克隆在染色體上的定位與文獻報道一致。Milosaljevic等1996年將大腸桿菌基因組DNA的15328個克隆制成微陣列，用997眾寡核苷酸探針進行雜交檢測，匯總結果通過計算機與E.coli序列資料庫相比較，用此技術一次可識別4.6MbDNA序列結構。

二，檢測表達狀況，發現新基因。Wodicka1997年將覆蓋酵母基因組全部ORF的26萬種25mer探針，陣列于4張玻片，每張6.5萬個探針，將酵母分加富和低限兩組培養，研究不同生長條件下基因表達水平，結果表明90%的基因在兩種條件下均表達，36種mRNA更多地在加富培養下表達，140種mRNA在低限培養中表達。此外，還發現了一批未見報道的新基因。

三，檢測突變和多態性進行遺傳作圖。Hacia等1996年用96600寡核苷酸陣列，檢測人癌基因BRCA1突變情況，將15個患者樣品和對照樣品分別用兩種熒光標記，發現14人的該基因發生了一個剪輯突變，共出現8種多態性，突變表現在該基因外顯子2的第22個密碼子內。利用SNP制作人類遺傳圖譜，將是第三代遺傳圖譜，此技術完全以DNA微陣列為基礎。

四，DNA序列分析。Donnel等1992，Pease等1994，Yershow等1996，Wallraff等1997都報道了采用DNA微陣列技術進行DNA序列分析。多數研究者采用先合成寡核苷酸序列制作微陣列，然后與標記的未知DNA序列雜交，通過熒光共聚焦顯微鏡掃描，計算機軟件分析得出數據，也有研究者將被測DNA片斷陣列，以標記的寡合苷酸為探針雜交測序。