DNA的測序技術4

３，染色，將膠板移至染色液中，搖床震蕩３０分鐘。

４，凝膠洗滌，將染色后的膠板，放入超純水中２－３秒后，迅速取出并豎起控水，隨后把膠板放入預冷的顯影液中（用量為總量的1/2），充分震蕩，當第一批條帶后，把膠板移入預冷的另一半顯影液中，震蕩，直至全部條帶出現。

注意：從放入水到放入顯影液中，之間時間不超過５－１０秒。

５，終止顯影，在顯影液中直接加入等體積的固定/終止溶液（第一步操作時用過的），停止顯影反應并固定影象。

６，洗滌凝膠，在超純水中洗滌凝膠２次，每次２分鐘。

７，膠板干燥，將顯影后的膠板置于室溫下，自然干燥。

８，干燥后的膠片可以永久保存，或進行拍照或進行EDF膠片拷貝。

（五）EDF膠片拷貝

EDF膠片拷貝能增強條帶的顯色強度

1:在暗室中將干燥后的膠板置于光源上(膠面向上)

2:裁一條EDF膠片,進行曝光時間的確定

3:在紅燈下,找到EDF膠片上有缺刻的一角,然后把EDF放于膠上,有缺刻的位置為左上角.在EDF上再放一干凈的玻璃板。

4:根據以確定的曝光時間,對EDF曝光。

5:顯影 在Kodax GBX顯影液中顯影1-5分鐘

6:水洗1分鐘

7:在Kodax GBX中定影3分鐘

8:水洗1分鐘.

9:烤干。

注意:

1： 鯊魚齒插入深度不能過深,否則可上樣量少,也不能過淺,否則易造成點樣槽滲漏,一般插入深度以0.5毫米為好。2：一定要進行預電泳,其作用為提高膠的溫度,防止DNA單鏈間的膠連3：上樣前應用1毫升槍吸打上樣孔,吸取樣品應盡量不把上層礦物油帶入,加樣動作要快,以防止擴散。4：本實驗所有部分尤其是（三），（四）、（五）三部分操作中一定要戴手套。

附錄1：未知模板的用量

[200bp(PCR產物) 16ng]

[3000-5000bp（超螺旋質粒DNA4μg]

[48000bp(λ或粘粒DNA 1μg]

2：測序反應中所用聚合酶的特性

酶 持續合成能力bp 聚合速率bp/秒

Klenow片段 15-20 45

AMV 未測 5

測序酶 2000 300

Taq酶 >7600 35-100

3：引物設計要求

1):堿基組成應勻稱，G+C含量為40-55%，長度為１８聚。如G+C含量在此值外，則長度應為18+n/2,對于AT豐富區，n=50-(G+C)%；對于GC豐富區，n=(G+C)%-50。2)，引物中不應含二重對稱區，以防止形成發夾或頸環結構。3):引物純度至少要到電泳級

4:各種溶液組成

5:ddNTP與dNTP的組成比例