DNA片斷的酶切實驗

DNA片段

TE緩沖液

離心機 恒溫水浴 取液器 電泳儀 電泳槽 紫外觀測儀

一、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ單酶切及雙酶切

1.  取2支干凈、滅菌新Eppendof管，分別按下表加入
 

  A（μl） B（μl） 滅菌水 13 13 EcoR Ⅰ緩沖液 2 0 Hind Ⅲ緩沖液 0 2 λDNA （或質粒DNA ） 4 4 EcoR Ⅰ 1 0 Hind Ⅲ 0 1 總體積 20 20

2.  37℃保溫1-4小時。

3.  保溫結束后65-70℃10 min 滅活酶（如為熱穩定性酶，則用氯仿抽提）。

4.  取2 μl 左右的反應液加入2 μl 電泳加樣緩沖液，電泳。

二、EcoR Ⅰ、Hind III雙酶切

1.  取一支干凈、滅菌Eppendof管，按下表加入各種試劑
 

加入試劑 體積（μl） 滅菌水 12 MULT buffer 2 λDNA（或質粒DNA） 4 EcoR Ⅰ 1 Hind Ⅲ   1 總體積 20

2.  37℃保溫1-2小時。

3.  保溫結束后65-70℃10 min 滅活酶（如為熱穩定性酶，則用氯仿抽提）。

4.  取2 μl 左右的反應液加入2 μl 電泳加樣緩沖液，電泳。

1.  樣品加入次序為水、緩沖液、DNA最后為酶，不應顛倒。

2.  加酶步驟要在冰浴中進行，在加酶前應先將水、緩沖液及待切DNA混勻。

3.  反應體積中水的量要盡量少，即反應體系的體積要盡量少，一般水解0.2~1 ug 模板DNA時，應將體積控制在20~30 ul 內。但要保證所加酶的體積不高于總體積的1/10，因為限制性內切酶是保存于50%甘油中的，如加酶體積高于總體積的1/10，則反應液中甘油濃度將大于5%，而此濃度將抑制內切酶活性。

4.  為了控制反應體積和促進反應進行，要求模板DNA的濃度應很高，否則反應體系中DNA濃度太低則將引起酶反應動力學改變、降低酶解效果，此時不得不增加反應體積；而一般為了增加DNA儲藏的穩定性，DNA多保存在TE緩沖液中，如反應體系中過多加入模板DNA溶液則勢必造成反應體系中EDTA濃度升高，而對酶產生抑制。因此如底物DNA濃度過低則應進行濃縮。

單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應溫度不同，這時可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求，加入第二種酶進行酶切；3）使用通用緩沖液進行雙酶切。具體要根據酶的反應要求進行，盡量避免活力損失。