DNA片段的亞克隆實驗

DNA

CIP dNTP DNA聚合酶 T4聚合酶 DTT ATP

水浴鍋 電泳儀 培養箱

1.  在20 μl 反應體積內用合適的酶完全消化DNA。75℃加熱15 min，滅活酶。如若無需進一步的酶促處理，接歩驟6。

2.  如果5’磷酸需要去除，加入2 μl 10×CIP緩沖液和1 U CIP，37℃溫育30~60 min，75℃加熱15 min終止反應。如無進一步的酶促處理，接步驟 6。

3.  如果1個或2個末端需變為平端，加入1 μl 含4種dNTP混合液（每種0.5 mmol/l） 和適量klenow酶或T4 DNA聚合酶，溫育（見圖一），75℃加熱15 min 化終止反 應。如果只需1個平端，可用適當的酶消化。如無進一步的酶促處理，接步驟6。

4.  若需加人寡核苷酸接頭，加入0.1~1.0 μg 的合適的寡核苷酸接頭，1 μl 10 mmol/l ATP，1 μl 0.2 mol/l DTT，20~100粘性末端單位的T4 DNA連接酶，15℃過夜， 75℃加熱10 min 以終止反應。

5.  用識別接頭的限制性內切酶切割步驟4的產物。如果兩個末端只有一個含有接頭，產 物加入另一種酶切割。

6.  用瓊脂糖凝膠電泳分離所需的片段，在紫外燈下，切下所需條帶，純化DNA。

7.  建立以下連接反應

（1）9 μl  DNA成分（0.1~5 μg）

（2）10 μl  2×鏈接緩沖液

（3）1 μl  10 mmol/l ATP

（4）T4 DNA連接酶（20~500粘性末端單位）

（5）15℃溫育24 h

8.  取1~10 μl 連接產物轉化感受態大腸桿菌，利用載體上的遺傳標記選擇重組子。

9.  用小量制備法純化質粒或噬菌體DNA，用限制性內切酶作進一步分析。
 

圖一、非匹配末端的DNA片段的連接


圖二、平端DNA與EcoR Ⅰ接頭連接