DNA的瓊脂糖凝膠電泳實驗

DNA瓊脂糖凝膠電泳的基本原理是利用DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時具有的電荷效應和分子篩效應。

電荷效應是指DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電，在電場中向正極移動，且相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，能以相同速率移動。通常，DNA泳動速率隨DNA片段長度的增加而減少，與電場強度成正比。

分子篩效應是指作為支持介質的瓊脂糖，具有網絡結構，使大分子物質在通過時收到較大阻力，依此分離不同大小的DNA片段。一般，DNA瓊脂糖凝膠電泳可分離50bp到百萬bp長度的DNA片段，視實際需求配制不同濃度和構型的瓊脂糖凝膠。

DNA片段

瓊脂糖 電泳緩沖液（1XTAE或0.5XTBE） 載樣緩沖液 熒光插入染料（溴化乙錠或SYBR Gold） DNA大小標準品（DNA Marker）

瓊脂糖凝膠電泳儀 紫外透射儀或紫外凝膠成像儀 微波爐 移液器 水浴鍋

1.  用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺上；

2.  調整好梳子的高度；

3.  稱取0.24 g瓊脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至45-50篊時倒入制膠板中；

4.  凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；

5.  將電泳樣品與溴酚藍混合后將樣品依次點入加樣孔中；

pUC185祃+ddH₂O₃祃+溴酚藍2祃共10祃于0.5 ml tube中混合后點樣；

6.  將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動；

7.  電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5礸/ml的溴化乙錠（EB）溶液中染色10－15min，清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結果，并照相記錄。

1.  影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：

（1）DNA分子大小與遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結構重復性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結構緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）

（2）膠濃度，U為遷移率，U0t 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Kr 為膠濃度，Kr為介質阻滯系數。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAt為DNA的自由電泳遷移率，
 

（3）DNA構象：一般遷移速率超螺旋環狀>線狀DNA>單鏈開環。當條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關。

（4）所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5 V/cm

（5）堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 ℃

（6）嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)

（7）電泳緩沖液 （0.5×TBE）的組成及其離子強度影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2.  溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。

3.  電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenol blue, Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。

常見問題原因分析

1. 跑出的DNA帶模糊？

（1）DNA降解：避免核酸酶污染。

（2）電泳緩沖液不新鮮：電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液。

（3）所用電泳條件不合適：電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度<30℃；巨大DNA鏈電泳，溫度應<15℃；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。

（4）DNA上樣量過多：減少凝膠中的DNA上樣量。

（5）DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。

（6）有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。

（7）DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

2. 有不規則DNA帶遷移？

（1）對于λ/Hind III片段cos位點復性：電泳前于65℃加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。

（2）電泳條件不合適：電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度<30℃；經常更換電泳緩沖液。

（3）DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

3. 跑出的DNA條帶弱或無條帶？

（1）DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量。

（2）DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

（3）DNA走出凝膠：正確連接電極方向避免插反的情況，縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。

（4）所用光源不合適：對于用EB染色的DNA應用短波長（254nm）紫外光源。

4. 跑出的DNA帶缺失不完整？

（1）如果是小DNA帶，可能跑出凝膠，可以縮短電泳時間或降低電壓或增強凝膠濃度。

（2）分子大小相近的DNA帶不易分辨，應延長電泳時間，并核準正確的凝膠濃度。

（3）DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

實驗方法出處來源《分子克隆實驗指南