DNA連接反應的影響因素

1、 連接緩沖液的影響：大體上緩沖液含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是維持還原性環境，穩定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/L的ATP，現多用1mmol/L，是酶反應所必需的。

2、 pH的影響：一般將緩沖液的pH調節到7.4-7.8，較多用7.8。有實驗表明，若把pH為7.5-8.0時的酶活力定為100%，那么體系偏堿（pH為8.3）時僅為全部活力的65%；當體系偏酸（PH為6.9）時僅為全部活力的40%。

3、 ATP濃度的影響：連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發現，ATP的最適濃度為0.5-1mmol/L，過濃會抑制反應。例如，5mmol/L的ATP會完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%被抑制；還有報道，當ATP的濃度為0.1mmol/L時，去磷酸載體的自環比例最大。

由于ATP極易分解，所以當連接反應失敗時，除了DNA與酶的問題外，還應考慮ATP的因素。含有ATP的緩沖液應于-20℃保存，溶化取用后立即放回。連接緩沖液體積較大時最好分小管貯存，防止反復凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時加入新配制的ATP母液。

4、 連接溫度與時間的影響：因為黏性末端的DNA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩定，但連接酶的最適溫度又恰為37℃。為了解決這一矛盾，在經過綜合考慮后，傳統上將連接溫度定為16℃，時間為4-16h。現經實驗發現，對于一般的黏性末端來說，20℃ 30min就足以取得相當好的連接效果，當然如果時間充裕的話，20℃ 60min能使連接反應進行得更完全一些。對于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發揮。

5、 酶濃度的影響：日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態低10-20倍，連接平末端時酶用量要比連接黏端大10-100倍。進行黏末端連接時需先行稀釋，稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時間保持活力，也便于隨時取用。

6、 DNA濃度的影響：要求得到環化的有效連接產物， DNA濃度不可過高，一般不會超過20nmol/L。要求線性化的連接產物， DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。在用大質粒載體進行大片段克隆時，以及在雙酶切片段的連接反應中，DNA濃度還應降低，甚至是DNA的總濃度低至幾個nmol/L。另據研究，T4 DNA連接酶對DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，所以，連接時DNA濃度不應低于1nmol/L。即應具有2nmol/L的末端濃度。

提高平端連接效率的方法：

1、 低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好，平端連接需要過夜反應。

2、 在體系中加一點切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點消失。這樣可避免載體自連，應該可以大大提高平端連接的效率。足夠多的載體和插入片段是最重要的 。要看片段具體情況而言，有時載體和片段濃度過高，容易產生線性化產物，不利于環化的。插入的DNA片段的摩爾數是載體摩爾數的5-10倍，這個很關鍵。載體通常50ng就夠了，若載體在10k左右，可用50－100ng。

3、 平端的連接對于離子濃度很敏感，回收的時候多洗洗，加PEG和擴大酶量，22度2小時后4C過夜。

4、 盡可能縮小連接反應的體積，最好不超過10微升，在5、6微升左右最佳。

5、 建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好。