DNA的酶切消化與凝膠回收

[實驗原理]

限制性內切酶是分子操作中重要的工具酶，是一類能夠識別雙鏈DNA分子某種特定的核苷酸序列并切割雙鏈DNA分子的核酸內切酶。可分為3類，Ⅰ和Ⅲ類限制酶兼有甲基化等修飾作用及以來ATP的限制性切割活性，前者結合于識別位點隨即切割DNA，后者則在識別位點切割。Ⅱ類限制酶是由兩種酶分子組成的復合體系，一種具有限制性內切酶功能，切割某一特定的核苷酸序列，另一種為獨立的甲基化酶，可修飾同一識別序列。

絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4-7個核苷酸且呈二重對稱的特異序列，切割位點相對于二重對稱軸的位置因酶而異，切割DNA后，有的產生平末端，有的產生粘性末端。應用限制酶：

（1）可提供DNA物理圖譜的特異性標記；

（2）酶切產生的特異性片段可用于分子克隆；

DNA分子經限制性內切酶消化以后，產生不同大小的DNA片段，我們需要從中分離出所需的目的片段，進一步做亞克隆或用作探針。通過瓊脂糖凝膠電泳可以將目的片段與其它DNA片段分開，然后從瓊脂糖凝膠中回收含有相應片段的液體，經酚/氯仿處理、乙醇沉淀就可以獲得符合要求的DNA片段。

[實驗目的]

1、利用限制酶消化質粒載體，掌握DNA限制性內切酶消化反應的原理和方法。

2、掌握DNA片段凝膠純化和回收的方法。

[實驗材料]

酶切的質粒和PCR片段， 1X TBE電泳緩沖液、0.8%瓊脂糖凝膠、酚/氯仿、無水乙醇、70%乙醇、3M醋酸鈉（pH5.2）、上樣緩沖液

[實驗儀器]

電泳儀、電泳槽、離心機、紫外透射檢測儀

[實驗用具]

微量取液器、吸管頭、刀片、1.5ml離心管、 0.5ml離心管、鑷子、玻璃棉、小針頭

[操作步驟]

1、酶切反應

按下表配制酶解混合液，混勻，37℃ 保溫2-4小時，加入上樣緩沖液終止反應，或－20℃保存。

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2、瓊脂糖凝膠電泳

（1）用1 x TAE緩沖液配制瓊脂糖凝膠：在電子天平上準確稱取瓊脂糖0.16g，倒入100mL三角瓶，加入20mL緩沖液。

（2）在微波爐上加熱40S。

（3）待冷卻至60℃左右時，加入1uL溴化乙啶，搖勻。

（4）將凝膠倒入預先準備好的制膠板上，插入梳子（制備電泳專用），置于室溫或4℃冰箱，待冷卻。

（5）將酶解液約100微升加入0.8％瓊脂糖膠的樣品孔中，將DNA分子量標準2微升加入小孔中，然后用80V電壓電泳20min。

（6）取出凝膠，在紫外燈下觀察，記錄觀察結果。　

3、從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段

（1）用小針頭在0.5ml離心管底部打洞，用玻璃棉塞住離心管底部。

（2）紫外透射檢測儀下觀察，用小刀片小心切出含有目的片段的凝膠。

（3）將凝膠條放入0.5ml離心管中，外套1.5ml離心管，5000rpm離心3分鐘。用微量取液器吸取1.5ml離心管中的液體，轉移到另一干凈的1.5ml離心管中。然后重復離心，直到將凝膠條中的液體全部轉移為止。

（4）用等體積酚/氯仿抽提。重復二次。

（5）加入0.1倍體積3M醋酸鈉及2.5倍體積無水乙醇。然后置-20℃冰箱30min。

（6）4℃條件下，15000rpm離心15min，棄上清液。

（7）用70%乙醇洗沉淀2次。將沉淀風干后，加入10微升H2O溶解沉淀，置-20℃冰箱保存。

[注意事項]

1、切凝膠在紫外燈下操作，應作好防護工作；操作應盡量快，避免DNA在紫外線照射下可能發生的突變。

2、切取含有目的片段的凝膠時，應盡量減少周圍凝膠的帶入。