ELISA實驗結果為何有時候會復測？

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、技術可靠、試劑穩定等優點，廣泛應用于傳染性疾病、腫瘤標志物以及激素等項目的檢測，但在ELISA實驗過程中時常會出現復測現象即我們時常說的"花板"現象，即空白、陰性對照、陽性對照及室內質控結果正常，血液標本吸光度(OD)值普遍偏高（或個別OD值偏高，經復查均為陰性）、弱陽性結果較多，而大多數真陽性標本出現弱陽性結果。

這種現象影響檢驗結果的正確判讀，對工作造成一定的不利影響，一旦出現“花板”，實驗結果必須放棄，重新進行，不僅浪費物料和時間，而且還會出現樣本量缺少、交叉污染、報告延遲等一系列問題。同時也給廣大獻血漿的愛心人士在當日等候化驗結果中加長等待時間，嚴重影響大家奉獻愛心的積極性。為此我們對“花板”現象進行了原因分析與總結，使“花板”降至最低限度，從而提高檢測的特異性，并得到更準確、更可靠的實驗結果。影響因素分析如下：

一、標本因素

正確處理標本，防止大規模溶血、血漿層異物、使用一次性加樣槍頭，防止交叉污染。血清和血漿均可以用于檢測，但血清的分離應在抽血后等血液完全凝固后再離心，以防止洗板因纖維蛋白堵塞洗板機，導致因洗板不充分引起“花板”。同時，溶血是由于紅細胞破裂引起的，血細胞成分血紅蛋白具有過氧化物酶特性，釋放到血漿或血清中，會催化底物而造成假陽性。

二、試劑因素

正確保存及使用有效試劑。使用過期試劑及底物接觸金屬容器、底物混合后放置時間較長均影響實驗結果的準確性。選擇試劑時應選擇靈敏度高、特異性好、穩定性好，批間差小的試劑。不同廠家的試劑不能混用，包括底物和洗滌液。檢測前應將試劑放置室溫平衡半小時，洗滌液應現用現配，同時觀察濃縮洗滌液中有無結晶，若有結晶應放37℃水浴中融化后才可使用。

三、技術人員操作因素 

嚴格按照相關實驗SOP操作實驗。加樣量的準確與否，直接影響抗原抗體結合物的濃度，直至最后顯色的深淺。加樣時應盡可能的垂直加樣，并加在包被孔的底部（注：勿應用力過度破壞底部包被物質），不可加在孔的上部及外部。實際工作中我們會發現，用加樣槍加酶和底物時，速度過快，有時會加在兩孔之間，所以操作時速度應適中，不可為了追求速度而不顧質量。具體情況因人而異。

四、溫浴的因素

使用水浴箱作為溫浴設備時，應注意水的深淺對結果的影響，當水浴箱中水的的實測溫度37℃時，則水面溫度可能只有34℃，空氣溫度更低，甚至只有二十多度，所以當水浴箱中水位過低時則酶標微孔板沒有浸入水中，則反應溫度會達不到37℃，相應的就會影響酶促反應。為防止邊緣效應，酶標板應盡量浸入水中，以保證受熱的均勻。水浴時，酶標板應封好，以免水滴滴入包被孔中，或陽性標本的蒸發。嚴格掌握溫浴時間，不可為了早點出結果擅自縮短溫浴時間。

五、洗板機的因素

洗板是ELISA實驗中至關重要的一步，它決定著試驗的成敗。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結晶，將堵塞洗板機針孔，造成全堵或半堵狀態，以致使未結合的酶標記物不能完全洗脫，而使最后底物顯色時加深，造成假陽性或“花板”。廢液瓶裝滿后應及時清空，以防止廢液回流對管道的污染，而使洗滌不徹底，造成“花板”。洗板結束后應用蒸餾水徹底清洗管道，以防止廢液在管道中的殘留。同時應根據儀器維護保養程序，定期對洗板機進行維護保養。

六、酶標儀

酶標儀應安置在避光條件下，比色前應提前15-30分鐘開機預熱，這樣測定結果會更穩定。為防止顯色的加深或減弱，顯色時間完成后應立即滴加終止液（避免氣泡產生），并在10分鐘內完成比色。酶標板從水浴箱取出后應擦凈孔底水滴，若有水滴或紙屑殘留在孔底，會造成酶標儀讀數錯誤，誤判定為“花板”。

總之，ELISA試驗看似是一項操作簡單的診斷技術，但其中涉及諸多環節，若任意一環節操作不當，將影響結果的判斷。即使在最佳條件下，不同廠家的試劑也會做出不同的結果，因此，對于ELISA試驗的結果解釋，我們只能說檢測到某種抗體或抗原，而不能作為一種確診試驗。為了避免“花板”問題的出現，降低檢測的假陽性率，獲得更理想的實驗結果，做出了以上總結及對策。