IL2質粒DNA探針制備的操作步驟

實驗概要

本實驗介紹了IL-2質粒DNA探針制備的詳細步驟。

實驗步驟

1. 含IL-2質粒DNA探針的提取

   1) 取含IL-2質粒DNA的單個菌落置兩個25ml LB培養基(含100μg/ml Amp)，37℃ 220r/min 振搖過液(約16h )；

   2) 取10ml菌液加200ml LB培養液(含100μg/ml Amp)，37℃ 150r/min振搖 4h；

   3) 加氯霉素(終濃度170μg/ml)，37℃ 220r/min振搖3h；

   4) 菌液倒入300ml離心管中離心，4℃ 5000r/min×10min離心棄上清除去殘液(吸水紙無菌)；

   5) 每管加40ml STE溶液(冰預冷)懸浮細菌后，用移液管轉入到50ml離心管中，4℃ 5000r×15min離心；

   6) 棄上清，加5ml溶液1(冰預冷)懸浮細菌，加1 ml新配制(pH8.0)的溶菌酶(10g/ml)，輕搖，室溫靜置5min；

   7) 加10ml溶液II，蓋上蓋子，將離心管小心顛倒數次混合液體，不要用旋渦振蕩器，冰浴10min，且勿搖動；

   8) 加7.5ml溶液III(冰預冷)搖振蕩離心管數次使之混合，冰浴20-30min，使沉淀完全，4℃ 12000r/min×20min離心；

   9) 取上清到另一50ml離心管中，加0.6體積異丙醇，混勻、室溫靜置15min，室溫5000r/min×15min離心棄上清；

   10) 用75%乙醇洗滌沉淀一次(不將沉淀懸浮)，將乙醇倒置吸水紙上，使乙醇揮發；

   11) 用1.5m1TE(pH8.0)將沉淀溶解加等體積冰預冷的5MLiCl，混勻后置冰溶10min，4℃12000r/min×10min離心；

   12) 取上清至新EP管，加等體積的異丙醇(約3ml)充分混合、室溫靜置15min，室溫12000rmin×10min離心(回收沉淀的核酸)；

   13) 小心去上清，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡，用75%乙醇洗滌沉淀，流盡乙醇，用吸低吸去附于管壁的液滴，將管倒置在紙巾上數分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發；

   14) 加入RNA酶(終濃度100μg/ml)用500u1TE溶解沉淀DNA，移至新EP管中，37℃水浴30min；

   15) 加等體積(500ul)含13%(W/V)PEG(800)的1.6mol/L NaCl，充分混合，4℃ 12000r/min×5min離心；

   16) 吸去上清用400u1TE(PH8.0)溶解質粒DNA沉淀；

   17) 加等體積飽和酚(400ul)混合，12000r/min×10min離心；

   18) 吸上層水相移至另一EP管加入等體積酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)劇烈混勻至乳白狀，12000r/min×10min離心；

   19) 吸上層水相移至另一EP管，加等體積氯仿：異戊醇(24:1)混勻，12000r/min×10min離心；

   20) 吸上層水相移至新EP管(硅化)、加入0.1體積的3mol/L NaAC(pH5.2)和2體積的-20℃，預冷的無水乙醇、混勻(可見沉淀出現)，置-20℃2h或0℃20min，4℃12000r/min×15min離心；

   21) 棄上清，加75%乙醇(4℃預冷)200u1，稍加振蕩，離心洗滌2次，4℃12000r/min×5min離心去上清；

   22) 敞開管口，將管置于實驗桌上直到最后可見的痕量與乙醇揮發，溶沉淀于11μlTE溶液中；

   23) 取1μl電泳其余進行酶切。

2. 經0.7%瓊脂凝膠電泳，確定有質粒DNA后，用XhoI進行酶切。

酶切反應體系：10μl質粒DNA，6μl內切酶XhoI，6μl 10 X酶切緩沖液，38μl蒸餾水，總體積為60μl；37℃消化過液。

3. IL-2 DNA片段的回收和純化

可以使用任何一種回收與純化DNA片段的方法，下面介紹的是用Wizard^TNPCR純化試劑盒回收IL-2 DNA片段。

   1) 將60μl酶切反應體系經1%瓊脂糖凝膠電泳；

   2) 紫外燈下切下IL-2 DNA片段，挑出凝膠到EP管中，加1 ml Resin，使凝膠深化；

   3) 用5ml一次性注射器將Resin/DNAmix轉移到Wizard Minicolumn中，

   4) 用2ml80%異丙醇洗滌Minicolum；

   5) 12000g離心20min；

   6) 將Minicolumn轉移至新EP管中，加50ul滅菌雙蒸水到Minicolumn中，12000g離心20S，收集DNA。