L929細胞增殖MTT比色法檢測IL1的生物活性

實驗概要

IL-1具有刺激多種來源的成纖維細胞增殖的作用，可用于IL-1生物活性檢測。目前國內外大多數實驗室常用L929細胞株(小鼠成纖維細胞瘤細胞)作為檢測IL-1生物活性的靶細胞或反應細胞。本實驗利用L929細胞增殖MTT比色法IL-1的生物活性進行了檢測。

實驗原理

MTT比色法的原理是利用四甲基偶氮唑鹽[3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]在活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，由淡黃色被還原成藍紫色或藍黑色的MTT-甲肷，形成的量與活細胞代謝率及細胞增殖程度成正相關。故通過反應細胞形成的MTT-甲肷量，即可測定IL-1對L929細胞促增殖作用程度，從而間接測定IL-1的生物活性。

主要試劑

1. 0.25%胰蛋白酶

2. 10%FCS-RPMI-1640完全培養液

3. MTT：用PBS稀釋成5mg/ml，用0.22μm膜過濾除菌及雜質，4℃避光保存。

4. 酸化異丙醇(含0.04mol/L HCl的異丙醇)：100ml異丙醇中加入0.4ml的36% HCl即可。

主要設備

96孔細胞培養板，刻度吸管，毛細吸管，加樣器(頭)，刻度離心管，離心機，細胞計數板，倒置顯微鏡，5%CO₂培養箱，超凈工作臺，酶標測定儀，570nm與630nm濾光片。

實驗材料

1. 已誘生的IL-1待檢樣品：倍比稀釋成不同濃度。

2. IL-1標準品：倍比稀釋成不同濃度。

3. L929細胞：作為反應細胞或靶細胞，存活率應>95%。

實驗步驟

1. 將生長狀況良好的L929細胞用0.25%胰蛋白酶消化2-3min；

2. 將L929細胞用10%FCS-RPMI-1640培養液洗滌2次，以去除消化液及原生長培養液；

3. 用10% FCS-RPMI-1640培養液調L929細胞濃度為2×10⁵/ml；

4. 將L929細胞懸液加至96孔細胞培養板，100μl/孔；

5. 分別加入不同倍比稀釋度的IL-1標準品和待測樣品于96孔細胞培養板中，100μl/孔，各設3個復孔，同時設立培養液空白對照；

6. 置37℃，5% CO₂培養箱中培養56h；

7. 將96孔培養板取出，各孔加入MTT，10μl/孔；

8. 置37℃，5% CO₂培養箱中繼續培養4h；

9. 取出培養板，先從各孔中輕輕吸出100μl上清液棄去，再加入酸化異丙醇或DMSO，100μl/孔，置室溫10~20min，吹打震蕩，充分混勻，使MTT-甲肷產物充分溶解；

10. 用酶標儀以檢測波長570nm，參考波長630nm，分別測定各孔OD值。測定應在酸化異丙醇加入后lh內完成。

注意事項

1. L929細胞存活率應>95%，L929細胞在培養條件不良時，可呈圓形漂浮狀，此時更換培養液可使其恢復為正常的梭形貼壁細胞。

2. 應充分洗滌后加入培養板中，且應均勻分散于各孔中，否則可能造成某個部位細胞過密而某個部位細胞過稀，影響細胞單層形成。

3. 標準品及待測樣品應從1:2開始至少6個倍比稀釋度。

4. 加樣時，應從低濃度到高濃度順序加入，不可共用加樣器頭。

5. 加入酸化異丙醇后，應在lh內進行OD值測定。

6. 還可按正態概率紙法或概率單位法計算IL-1的活性單位。