MassARRAY核酸質譜實驗操作方法與技巧

     實驗總是從樣品開始，完善的樣品質控和挑選是整體測試成功的關鍵。MassARRAY平臺適合多種來源樣本的檢測，比如血液，口腔拭子，顯微切割和新鮮冰凍組織、毛囊等等，總共僅需10ng DNA即可完成數十個位點的檢測。提取的DNA可在4℃保存24小時，如需要放置超過24小時，則需將DNA樣品保存于-20℃條件下，A260/A280應在1.7-2.0之間。

      對于不同分子量的片段，質譜儀的檢測效率不同，為了使各個位點的檢測效率達到較一致的水平，需要將體系中的延伸引物UEP調整到適當的濃度。具體方法如下：

將2μL UEP mix用超純水稀釋到50μL，按照通用流程進行質譜檢測，比較每一條UEP的峰高。根據每一條UEP的加樣量和峰高，按照正比計算，補加或者調整對應的UEP。通過濃度調整，達到最低峰高度為最高峰高度的一半即可。考慮到國內引物合成的批間差，建議每次新引物訂購后都進行延伸引物UEP 的檢查。

調整前

調整后

     轉化率可以用來判斷延伸引物的轉化效率以及樣本是否因缺少轉化產物而導致檢測失敗。

轉化率較差

轉化率較好

     如果在新panel驗證實驗中發現某些位點有轉化率較低的問題，可以通過調整PCR引物、更改延伸引物等方法來優化和改進。一旦panel優化完畢，該設計就可以確定下來并一直使用下去。

      NTC即No Template Control，也即用水來代替模板進行實驗。可用來檢測體系中是否有非特異延伸以及環境中是否存在氣溶膠污染，采用新的檢測panel時，建議實驗過程中每一組assay都加入一個NTC，這樣可以方便地確認該panel的表現度是否符合預期，以及在哪些方面需要優化和改進。

     Calibrant是含有不同大小oligo的標準品，可以作為陽性對照判斷儀器是否正常運行，激光是否需要調整。每張芯片都有專門用于Calibrant的matrix pad，按照說明書取一定量的Calibrant放入對應位置，在點樣和質譜分析時勾選對應選項即可。

      Agena的技術人員在提供技術支持的時候，一般都需要查看NTC以及Calibrant的情況。

     通過計算機完成了Panel設計后，總是要通過真實的驗證實驗來確定原先的設計是否可靠，以及是否需要針對某些位點做改進和優化。一般來說，大部分的位點都會表現良好，但是如果有某些位點與預期有偏差，也有相應的解決方案，比如：

i）PCR引物加倍：適用于位點轉化率低的情況

ii）重新設計PCR引物：適用于位點擴增失敗或者轉化率低的情況

iii）反向UEP設計：適用于正向UEP有不可避免的dimer或者hairpin等影響延伸或者延伸失敗的情況