NatureMethods|單細胞多模態測序的未來：UDAseq如何引領新革命？

近年來，單細胞RNA測序技術（scRNA-seq）在揭示復雜生物系統和探索遺傳學及臨床研究中取得了突破性進展。然而，僅依賴單一的轉錄組信息往往難以區分分子相似但功能差異顯著的細胞類別。因此，融合多種模態信息的單細胞測序技術逐漸成為研究熱點，通過同時獲取單個細胞的多維數據，研究人員能夠更全面地解析細胞狀態及其功能互作。然而，目前大多數多模態單細胞測序技術成本高昂、通量有限，難以大規模應用，尤其在臨床樣本分析和自動化處理方面存在諸多限制。

為了解決上述難題，1月20日Nature Methods的研究報道“UDA-seq: universal droplet microfluidics-based combinatorial indexing for massive-scale multimodal single-cell sequencing”，研究人員開發了一種基于微液滴技術的組合標記方法——UDA-seq（Universal Droplet-based combinatorial indexing for multimodal Single-cell sequencing）。這一通用性流程通過引入后索引步驟（post-indexing），顯著提高了測序的通量與靈活性，并能夠系統適配現有的微液滴單細胞多模態測序方法。在研究中，UDA-seq成功應用于RNA與基因組開放染色質的聯合檢測（RNA+ATAC）、RNA與CRISPR干擾的聯合檢測等多模態分析。通過對多個組織類型和細胞樣本的實驗驗證，UDA-seq不僅能夠高效生成超過10萬個高質量單細胞數據，還展現出在發現稀有細胞亞群和解析復雜疾病機制方面的強大能力。

這一技術的獨特之處在于，通過兩輪索引標記單細胞核酸片段，既提高了數據的唯一性識別能力，又降低了實驗成本，使得包括冷凍臨床活檢樣本在內的多種樣本的多模態測序成為可能。特別是在臨床領域，UDA-seq成功分析了腎臟疾病相關的樣本，鑒定了與蛋白尿和腎損傷相關的關鍵細胞亞群和調控因子。這些發現不僅揭示了疾病發生的細胞和分子機制，也為開發新的診斷和治療方法提供了有力支持。

UDA-seq代表了一種經濟高效且高度可擴展的單細胞多模態測序解決方案，為基礎生物學和醫學研究開辟了新的可能性。這項技術的廣泛應用，有望進一步推動我們對細胞功能與疾病機制的深入理解，為精準醫學的發展奠定基礎。

單細胞時代的挑戰與機遇

單細胞測序技術正以前所未有的速度改變我們對生物系統的理解。通過解析單個細胞的基因表達、表觀遺傳狀態及功能特性，這一技術已成功揭示了組織內細胞多樣性的本質。例如，單細胞RNA測序（scRNA-seq）在精準識別細胞類型、狀態及功能上展現了無與倫比的潛力，為遺傳學、發育生物學和癌癥研究帶來了顛覆性進展。

然而，僅僅依靠單一模態的測序技術仍有局限性。比如，單細胞轉錄組數據雖然能夠揭示細胞間的分子差異，但對于功能上密切相關或狀態過渡中的細胞類型卻往往難以區分。而且，單一數據模態難以全面展示細胞內復雜的分子機制及其調控網絡。例如，同一細胞中的基因表達模式和染色質可及性之間的互作，或RNA轉錄與蛋白功能調控的關系，都需要多模態的數據進行解析。這些問題的存在使得多模態單細胞測序技術成為當前科學研究的迫切需求。

然而，現有的多模態單細胞測序方法仍面臨成本高昂、通量有限及適配性較差的困境。例如，許多方法需要為不同類型的實驗設計專門的實驗流程，這不僅降低了效率，還增加了實驗的不確定性。特別是在臨床領域，研究者常需要分析冷凍或固定樣本，而現有技術對這些樣本的適配性和穩定性卻不足，嚴重限制了其實際應用。

為了應對上述挑戰，研究人員開發了基于微液滴的組合標記方法——UDA-seq（Universal Droplet-based combinatorial indexing for multimodal Single-cell sequencing）。這一技術通過兩輪索引標記步驟，創新性地解決了現有方法的多重限制。它不僅顯著提升了單細胞測序的通量，還優化了對復雜樣本的兼容性，從而為多模態單細胞數據的獲取提供了新的解決方案。通過UDA-seq，研究人員能夠從單一實驗中同時獲取RNA、染色質開放區域以及CRISPR干擾的多種信息，實現了超過10萬個高質量單細胞數據的生成，并成功應用于腎臟疾病、癌癥等領域的研究。

什么是UDA-seq？

UDA-seq是一種基于微液滴技術與組合標記的單細胞多模態測序方法，旨在突破傳統測序技術的通量與適配性限制。其核心理念是將單細胞樣本封裝在微液滴中，利用兩輪標記策略實現對核酸片段的精準標記。

在第一輪標記中，單細胞或細胞核通過微液滴技術被分裝到含有條形碼的液滴中，條形碼充當細胞的“身份證”，為每個液滴內的核酸分子提供唯一標識。接著，液滴中的細胞核被釋放并與其他液滴樣本混合后進行第二輪標記。這一步采用96或384孔板的孔位條形碼，再次為每個核酸分子添加獨特標記。通過這兩輪標記，UDA-seq不僅能夠確保核酸分子的唯一性標記，還顯著提高了條形碼組合的多樣性，理論上可生成960萬至3800萬種組合。

這種設計的另一個優點在于可以顯著降低數據沖突率。在實際實驗中，單細胞數據沖突率僅為1.23%（傳統單輪索引標記方法為6.29%），證明其在解析單細胞核酸片段時的高精確性和低誤差率。

UDA-seq的技術特點：高通量、低成本與靈活性

UDA-seq的顯著優勢之一是其高通量能力。在實驗中，研究人員通過加載50萬個細胞，生成了超過10萬個高質量單細胞數據，顯著優于許多現有方法。此外，UDA-seq具備高度的樣本兼容性，可以處理包括冷凍組織、固定細胞在內的多種樣本類型，充分展現了其在臨床和科研中的廣泛適用性。

此外，成本也是顯著降低。傳統多模態單細胞測序技術往往成本高昂，而UDA-seq通過優化流程和提高數據利用率，實現了每個樣本15至20倍的成本下降。更重要的是，這種技術對現有設備要求較低，無需額外的硬件配置，使得許多實驗室都能輕松實現升級應用。

如何驗證UDA-seq的能力？

物種混合實驗：解析細胞特異性

驗證UDA-seq能力的重要一步是通過物種混合實驗（species-mixing experiments），評估其對不同細胞來源的精準解析能力。研究人員選用了人類HeLa細胞和小鼠NIH 3T3細胞進行混合實驗，這是單細胞測序中常用的技術驗證手段。通過這種方法，可以測試測序系統區分不同物種細胞的準確性。

實驗結果顯示，UDA-seq能夠成功識別99.1%的人類和小鼠細胞，其數據解析的高精確性遠超傳統方法。這種分辨能力得益于UDA-seq的兩輪索引策略，其確保了每個單細胞片段都帶有獨特的雙重條形碼，從而避免了數據沖突。更重要的是，實驗中幾乎未觀察到跨物種的假陽性結果，這進一步證明了UDA-seq在處理復雜混合樣本時的優越性。

與現有方法的對比分析：低沖突率與高數據保真度

UDA-seq在多模態測序領域的突破還體現于其與現有技術的對比中。一個顯著的優勢是其低沖突率（collision rate），即多個細胞核酸片段誤標為同一來源的比例。在傳統單輪索引標記方法中，沖突率通常高達6.29%，這嚴重影響了數據質量。而UDA-seq通過雙重索引標記，將這一比例降至1.23%，大幅提高了數據保真度。

除了沖突率的降低，UDA-seq還在多模態數據整合的質量上表現出色。以RNA和ATAC（染色質開放性）聯合分析為例，UDA-seq生成的多模態數據在解析基因表達與染色質狀態的相關性方面展現了更高的分辨率。這為進一步探索基因調控網絡提供了新的技術支撐，也為基因表達與表觀遺傳機制的聯合研究開辟了新途徑。

冷凍樣本中的挑戰與解決方案

單細胞測序技術在處理冷凍樣本時通常面臨樣本降解和數據質量下降的挑戰。然而，UDA-seq通過優化實驗流程，成功突破了這一限制。在實驗中，研究人員選用了腎臟活檢樣本進行測試。這類樣本由于細胞狀態的不穩定性和復雜性，一直是單細胞測序技術的瓶頸。

實驗結果表明，UDA-seq能夠在冷凍樣本中實現高質量的單細胞多模態數據生成。例如，在腎臟樣本的RNA與ATAC聯合分析中，研究人員不僅成功鑒定出與腎功能相關的關鍵基因表達模式，還發現了一些與蛋白尿和腎損傷相關的稀有細胞群體。這些發現為理解腎臟疾病的細胞與分子機制提供了寶貴線索。

值得注意的是，UDA-seq的適配性使其能夠處理多種冷凍樣本，包括癌癥活檢和神經組織。這一特性極大地拓展了單細胞多模態測序的應用范圍，尤其在需要分析保存樣本的臨床研究中表現出巨大的潛力。

UDA-seq的工作流程及其在多模態和多樣本分析中的表現（Credit: Nature Methods）

a. UDA-seq的工作流程

UDA-seq的實驗流程，包括兩輪條形碼標記（barcoding）。第一輪標記通過微液滴技術為每個單細胞分配唯一條形碼，隨后經過細胞混合后進行第二輪標記，這一步通過孔板條形碼進一步為核酸片段添加唯一標識。兩輪索引策略確保了數據的高通量和高保真度。

b–d. 物種混合實驗的結果

物種混合實驗用來驗證UDA-seq在不同條件下的性能：

b. 單細胞3′-RNA測序：采用96孔板進行后索引。實驗表明，UDA-seq能夠精確區分人類和小鼠細胞，具有高精度的物種特異性解析能力。

c. 單細胞核3′-RNA測序：通過16孔板后索引實現，進一步展示了在更復雜樣本中的穩定性。

d. 單細胞核多模態測序（scMultiome）：利用16孔板后索引同時獲取RNA和ATAC數據，證明了UDA-seq在多模態整合分析中的優越性能。

e, f. 基因和峰值信號的檢測能力比較

e. RNA與ATAC數據的對比：通過小提琴圖顯示，UDA-seq的scMultiome數據與10x Genomics相比，能夠檢測到更多的基因（RNA）和染色質開放性峰值（ATAC）。中位數顯示，UDA-seq在基因和峰值檢測數量上明顯優于對照方法。

f. sc5′-RNA測序：同樣的對比分析顯示，UDA-seq在基因檢測范圍和數據質量上顯著優于10x Genomics，特別是在檢測稀有表達基因方面表現突出。

g. UDA-seq與10x Genomics在免疫受體庫分析中的比較

在免疫受體（T細胞受體和B細胞受體）檢測中，UDA-seq的表現超過10x Genomics：使用Next GEM（Kit_v2）和GEM-X（Kit_v3）的UDA-seq能夠檢測到更高比例的T細胞受體（TCR）和B細胞受體（BCR）。這一結果表明，UDA-seq在免疫系統分析中具有更高的靈敏度和數據深度。

h. 超高通量單細胞RNA測序

UDA-seq還展示了在超高通量分析中的潛力：單個實驗中對超過15萬個細胞進行了5′-RNA測序，并通過UMAP聚類分析鑒定出44種不同的細胞類型。這些細胞類型在UMAP圖上以不同顏色標識，展現了其卓越的分辨率。

j. 稀有細胞類型的鑒定

通過UDA-seq技術，研究人員成功識別出多個稀有細胞類型，并通過標簽清晰標注。這一能力特別適用于解析組織中的細胞異質性，以及在疾病研究中發現關鍵的稀有細胞群體。

多模態聯合測序的突破

多模態測序的核心價值在于同時揭示不同層次的分子信息，為深入解析復雜的生物學機制提供了全新視角。UDA-seq的技術設計極大地擴展了多模態分析的可能性，其靈活性和通用性使得研究人員能夠從單一實驗中同時獲取多種數據類型。

RNA與開放染色質（ATAC）的聯合分析

轉錄組（RNA）和染色質開放性（ATAC）是揭示基因調控網絡的關鍵。RNA測序可以提供基因表達的直接信息，而ATAC-seq則揭示基因表達背后的表觀遺傳調控。通過UDA-seq的多模態聯合分析，研究人員能夠在單細胞水平同時獲取這些信息，從而直接關聯基因表達與其調控區域的狀態。

在實驗中，研究人員利用UDA-seq對不同類型組織進行了RNA+ATAC聯合分析，發現這種方法能夠精確定位細胞類型特異性的染色質開放區域，并揭示與基因表達直接相關的調控因子。例如，在免疫細胞研究中，UDA-seq幫助發現了T細胞中染色質開放性與特定細胞狀態（如活化或抑制）之間的關聯。這一發現為解析免疫系統的動態調控機制提供了有力工具，同時也為免疫疾病的靶點研究開辟了新的路徑。

RNA與免疫受體庫（VDJ）的聯合分析

免疫受體（如T細胞受體和B細胞受體）的多樣性是免疫系統識別和對抗病原體的基礎。傳統的免疫受體測序技術通常與轉錄組分析分離進行，難以關聯單個細胞的免疫受體譜系與其功能狀態。UDA-seq通過結合RNA測序與VDJ重組分析，使得單細胞水平的全面免疫研究成為可能。

在驗證實驗中，研究人員利用UDA-seq對來自健康個體和衰老個體的外周血單核細胞（PBMC）進行了分析。結果顯示，該技術能夠同時解析T細胞和B細胞的受體序列，并將其與細胞的轉錄狀態直接關聯。例如，研究揭示了衰老個體中B細胞受體多樣性的下降，同時伴隨著炎癥相關基因的表達上調。這一發現不僅加深了對衰老免疫系統特征的理解，也為開發新型免疫治療提供了重要線索。

RNA與CRISPR干擾的聯合分析

CRISPR干擾（CRISPR interference, CRISPRi）技術是一種高效的基因調控工具，能夠通過抑制目標基因的表達，研究其功能。然而，傳統CRISPR篩選方法通常在細胞群體水平上進行，無法解析單細胞層面的異質性。UDA-seq將RNA測序與CRISPRi篩選結合，使研究人員能夠在單細胞水平評估基因干擾的效果。

在針對腎臟疾病的實驗中，研究人員通過UDA-seq分析CRISPRi對腎小管細胞的基因調控作用。結果發現，干擾特定的轉錄因子基因能夠顯著改變腎小管細胞的轉錄模式，并誘導細胞進入特定的應激狀態。這些發現為進一步探索腎臟病理機制提供了重要信息，同時也證明了UDA-seq在基因功能研究中的巨大潛力。

稀有細胞亞群的發現

腎臟疾病研究中的關鍵細胞群體鑒定

腎臟疾病的研究長期以來面臨著細胞異質性高、稀有細胞難以檢測的挑戰。UDA-seq的出現為解決這一問題提供了新的技術支持，通過高通量和高精度的單細胞多模態測序方法，研究人員成功鑒定了與腎臟疾病密切相關的關鍵細胞亞群，為疾病的診斷和治療開辟了新途徑。

在針對腎臟活檢樣本的研究中，研究人員利用UDA-seq對腎臟不同區域的單細胞進行了分析。這些樣本包含了健康對照和多種病理狀態，包括蛋白尿和急性腎損傷（AKI）。通過多模態測序，研究團隊不僅解析了腎臟細胞的主要組成，還在病變區域中發現了幾個關鍵的稀有細胞亞群。例如，在急性腎損傷樣本中，UDA-seq檢測到一種獨特的腎小管細胞亞群，這些細胞表現出明顯的應激反應基因上調以及炎癥信號的激活。

這種稀有細胞的存在在傳統方法中難以被識別，但通過UDA-seq，研究者能夠精確量化其分布比例，并進一步揭示其在疾病進展中的潛在作用。

與蛋白尿及腎功能受損相關的分子機制

蛋白尿是多種腎臟疾病的重要癥狀之一，其背后隱藏著復雜的細胞和分子機制。通過UDA-seq，研究人員對腎臟蛋白尿樣本中的單細胞進行了深入的分子特征分析，并成功解鎖了一些關鍵機制。

研究顯示，在蛋白尿患者的腎小球區域，UDA-seq鑒定出一種高表達炎癥相關基因的稀有巨噬細胞亞群。這些細胞不僅釋放促炎細胞因子，還與腎小球基底膜損傷高度相關。同時，在腎小管區域，研究發現一種代謝異常的上皮細胞亞群，這些細胞呈現出顯著的線粒體功能失調和氧化應激反應。這些異常的細胞活動模式為蛋白尿的發生和發展提供了新的解釋。

此外，UDA-seq揭示了蛋白尿樣本中一些關鍵轉錄因子的表達變化。例如，研究發現HNF1B和NRF2在蛋白尿患者樣本中的表達顯著下降，這可能是腎小管上皮細胞失去屏障功能的重要原因。這些結果進一步支持了蛋白尿的分子機制不僅涉及局部炎癥反應，還包含復雜的代謝和轉錄調控網絡。

免疫系統老化的細胞學特征

人體衰老與T細胞、B細胞的動態變化

隨著年齡增長，人體免疫系統逐漸發生功能衰退，這一現象被稱為“免疫衰老”。UDA-seq通過單細胞多模態測序技術，為免疫系統在衰老過程中的細胞學變化提供了全新視角。

研究人員利用UDA-seq對來自年輕個體和衰老個體的外周血單核細胞（PBMC）進行了系統分析。結果顯示，與年輕人相比，衰老個體的T細胞和B細胞群體發生了顯著的數量和功能變化。其中，效應性T細胞（effector T cells）的比例顯著上升，而初始T細胞（na?ve T cells）顯著減少。這一變化反映了免疫系統逐漸向記憶性狀態轉變，但同時也伴隨著免疫應答能力的下降。

對于B細胞，衰老個體中未成熟B細胞和記憶B細胞的比例發生了動態變化，呈現出炎癥相關基因的高表達特征。這表明，在衰老免疫系統中，B細胞不僅參與抗體生成，還可能參與慢性炎癥的維持，這與衰老相關的多種疾病密切相關。

此外，UDA-seq還揭示了一些與衰老相關的關鍵分子變化。例如，FOXP1基因在初始T細胞中的表達顯著降低，而CXCL13在記憶B細胞中的表達上調。這些分子標志物為深入研究免疫衰老的分子機制提供了重要線索。

γδT細胞與自然殺傷細胞的關鍵作用

γδT細胞和自然殺傷（NK）細胞是免疫系統中兩類重要的先天性免疫細胞，在維持免疫監視和抗病原體功能中扮演關鍵角色。通過UDA-seq的分析，研究人員發現，衰老對這兩類細胞的功能和數量產生了顯著影響。

在γδT細胞中，衰老個體表現出顯著的功能多樣性下降。一些亞群的γδT細胞失去了分泌促炎性細胞因子的能力，而另一些亞群則表現出過度的炎癥反應，這種不平衡可能是衰老過程中免疫功能紊亂的表現。此外，研究發現，γδT細胞中與代謝相關的基因（如PPARγ和SIRT1）表達顯著下降，這表明代謝功能的衰退可能是其活性降低的重要原因。

對于自然殺傷細胞，衰老個體中其總數量顯著減少，同時一些關鍵功能基因（如GZMB和PRF1）的表達下降，導致NK細胞的殺傷能力受損。更重要的是，UDA-seq揭示了衰老NK細胞中染色質開放狀態的變化，暗示其基因表達調控機制發生了深刻的改變。

有趣的是，盡管總體功能受損，一些NK細胞亞群在衰老個體中卻表現出增強的分泌功能，可能與慢性炎癥的維持有關。這一發現為理解衰老相關的慢性疾病提供了新的研究視角。

多模態測序的藍圖

作為一種突破性的單細胞多模態測序技術，UDA-seq正在從根本上改變基礎生物學和精準醫學的研究方式。在基礎研究中，UDA-seq為探索復雜生物系統中的細胞異質性、稀有細胞群體及分子調控網絡提供了前所未有的工具。例如，通過在腎臟疾病、免疫衰老等領域的應用，UDA-seq已證明其在發現關鍵細胞亞群和揭示基因調控機制方面的獨特優勢。

此外，精準醫學的核心目標是實現個性化的疾病診斷與治療，而這需要對患者樣本進行全面且高分辨率的分子解析。UDA-seq的多模態特性使其能夠同時獲取轉錄組、表觀遺傳信息和基因干擾數據，從而構建更加完整的分子圖譜。這種能力對于癌癥、神經退行性疾病及免疫相關疾病的研究尤為重要。隨著臨床樣本適配性的不斷優化，UDA-seq有望成為精準醫學的重要工具，幫助研究人員識別個體化治療的最佳靶點并評估治療效果。

單細胞技術發展的下一步：從單細胞到細胞網絡的解讀

盡管單細胞測序技術已經能夠深入解析單個細胞的分子特征，但生命現象往往依賴于細胞之間的相互作用和網絡關系。因此，單細胞技術的下一步發展方向是從解析單細胞擴展到構建細胞網絡，這對于理解組織內的細胞通訊和系統調控尤為重要。

UDA-seq的多模態特性為這一方向提供了技術支持。例如，在免疫系統研究中，研究人員可以利用UDA-seq同時解析T細胞的轉錄狀態和其與其他細胞的相互作用。通過構建細胞通訊網絡，揭示炎癥或疾病狀態下的信號傳遞路徑。未來，結合空間轉錄組學，UDA-seq或可幫助研究人員在空間維度上進一步精確定位這些相互作用，為構建動態的細胞網絡模型提供更多數據支持。

此外，UDA-seq在稀有細胞群體的發現和功能研究中的表現，為理解組織修復、發育和疾病進程中的細胞協同作用提供了新思路。這種從單細胞到細胞網絡的跨越性進展，代表了單細胞測序技術發展的新高度。

多模態大數據與人工智能的結合

隨著多模態測序技術的普及，科學研究將產生海量的單細胞數據。這些數據包含轉錄組、表觀遺傳組及功能組等多個維度的信息，如何整合和解析這些復雜數據，成為未來的一大挑戰。而人工智能（AI）的引入，為多模態數據的深度解析提供了可能。

UDA-seq生成的大量高質量數據為機器學習和深度學習算法提供了理想的訓練數據集。例如，AI算法可以被用于識別不同疾病狀態下的特定細胞亞群模式，預測關鍵基因調控網絡，甚至為藥物靶點篩選提供輔助支持。同時，AI技術還可以自動化處理UDA-seq數據中可能存在的技術噪聲，提高分析的準確性和效率。

更重要的是，AI與UDA-seq的結合不僅局限于數據分析，還可以用于結果的可視化和實驗設計的優化。例如，AI算法可以根據現有數據模型預測實驗參數，為研究人員提供更高效的實驗方案。這種結合將大幅提高研究效率，并推動技術在實際應用中的落地。

UDA-seq不僅開創了單細胞多模態測序的新時代，也為基礎研究和精準醫學的發展提供了強大的技術支撐。未來，隨著單細胞技術向細胞網絡解析的深入發展，以及多模態數據與人工智能的深度結合，UDA-seq有望成為更多領域的核心工具，推動生命科學研究邁向一個更加全面和精準的階段。

參考文獻

Li Y, Huang Z, Xu L, Fan Y, Ping J, Li G, Chen Y, Yu C, Wang Q, Song T, Lin T, Liu M, Xu Y, Ai N, Meng X, Qiao Q, Ji H, Qin Z, Jin S, Jiang N, Wang M, Shu S, Zhang F, Zhang W, Liu GH, Chen L, Jiang L. UDA-seq: universal droplet microfluidics-based combinatorial indexing for massive-scale multimodal single-cell sequencing. Nat Methods. 2025 Jan 20. doi: 10.1038/s41592-024-02586-y. Epub ahead of print. PMID: 39833568.