PAGE膠制備方法

實驗概要

SDS-PAGE是對蛋白質進行量化，比較及特性鑒定的一種經濟、快速、而且可重復的方法。該法是依據混合蛋白的分子量不同來進行分離的。

SDS是一種去垢劑，可與蛋白質的疏水部分相結合，破壞其折疊結構，并使其廣泛存在于一個廣泛均一的溶液中。SDS蛋白質復合物的長度與其分子量成正比。在樣品介質和凝膠中加入強還原劑和去污劑后，電荷因素可被忽略。蛋白亞基的遷移率取決于亞基分子量。用于分離蛋白質和寡核苷酸。   作用原理  聚丙烯酰胺凝膠為網狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態，并依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。

主要試劑

1. 5x樣品緩沖液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巰基乙醇，1ml 1％溴酚藍，0.9ml蒸餾水。可在4℃保存數周，或在－20℃保存數月。

2. 凝膠貯液：在通風櫥中，稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。過濾后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1個月。

3. pH8.9分離膠緩沖液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7濃縮膠緩沖液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液

6.10％過硫酸銨（用重蒸水新鮮配制）

7. pH8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸餾水約900ml，調pH8.3后，用蒸餾水定容至1000ml。置4℃保存，臨用前稀釋10倍。

8. 考馬斯亮藍G250染色液：稱100mg考馬斯亮藍G250，溶于200ml蒸餾水中，慢慢加入7.5ml 70％的過氯酸，最后補足水到250ml，攪拌1小時，小孔濾紙過濾。

主要設備

電泳儀，電泳槽，水浴鍋，搖床。

實驗步驟

1.   樣品制備

將蛋白質樣品與5X樣品緩沖液（20ul＋5ul）在一個Eppendorf管中混合。放入100℃加熱5－10min，取上清點樣。

2.   分離膠及濃縮膠的制備

1)   將玻璃板、樣品梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用ddH2O沖洗數次，再用乙醇擦拭，晾干；

2)   將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ說明書提示裝好玻璃板；

3)   按如下體積配制10％分離膠8.0 ml，混勻；

ddH2O 3.0 ml

1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml

30％ Acr-Bis 2.8 ml

10％ SDS 80 ul

10％AP 56 ul

TEMED 6 ul

4)   向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20 min后膠即可聚合；

5)   按如下體積配制6％濃縮膠3.0 ml，混勻；ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis

2.0 ml 400 ul 600 ul

10％ SDS 10％ AP TEMED

36ul 24ul 4ul

6)   將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；

7)   裝好電泳系統，加入電極緩沖液，上樣20 μl;

8)   穩壓200V，溴酚藍剛跑出分離膠時，停止電泳，約需45 min～1hr.

9)   卸下膠板，剝離膠放入染色液中，室溫染色1～2 hr；加入脫色液，置于80 rpm脫色搖床上,每20 min更換一次脫色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸餾水）至完全脫凈。