PacBio測序有望掀起下一場遺傳診斷的革命

　　從一代到二代再到三代，近年來測序技術的發展勢不可擋。單分子測序也逐漸表現出它的優勢，在測序舞臺上發揮著舉足輕重的作用。近日，比利時魯汶大學和瑞典烏普薩拉大學的研究人員在《Nucleic Acids Research》發表綜述文章，介紹了PacBio SMRT測序技術在臨床中的應用。

　　文章簡單回顧了測序技術的發展史，從第一代的Sanger測序，到第二代以Illumina為代表的短讀長高通量測序，再到第三代的單分子測序技術，包括SMRT測序和納米孔測序。單分子測序的優勢在于讀長特別長，超過20 kb。因此，它們能夠測序重復元件，直接定相變異，甚至直接檢測表觀遺傳修飾。

　　“SMRT測序開辟了新的診斷途徑，比如通過單次檢測能以單堿基分辨率確定串聯重復的長度、序列中斷，甚至表觀遺傳修飾，”作者寫道。“對于某些應用，長讀長測序已被認為是金標準，如組織移植時的HLA基因分型。”

　　隨后，文章還回顧了SMRT測序在多個領域中的應用，包括串聯重復疾病、HLA分型、生殖基因組學、癌癥，以及微生物和病毒遺傳檢測。

　　串聯重復異常引起了40多種神經細胞疾病，包括脆性X綜合征、脊髓小腦性共濟失調等。SMRT測序研究的第一個串聯重復是FMR1的CGG重復。健康個體攜帶大約30個CGG重復，若重復數超過200個，則會造成脆性X綜合征。作者指出，用更快更直接的SMRT測序來取代Southern Blot，將大大提高FMR1及其他重復疾病的診斷水平。

　　HLA區域的基因分型，對診斷自體免疫疾病以及在器官移植中選擇供體很關鍵。這個區域的基因是高度多態性的，這使得此區域很難用短reads來定位，而長reads有了用武之地。目前，許多大型的HLA分型實驗室都利用SMRT測序來分析I類及II類的等位基因。這項技術逐漸成為器官移植和干細胞移植中的金標準。

　　在癌癥方面，SMRT測序技術也應用于一些白血病的診斷。慢性粒細胞白血病（CML）由9號和22號染色體之間的易位引起，產生了BCR-ABL1融合蛋白。CML患者通常用酪氨酸激酶抑制劑來抑制BCR-ABL1，但可能誘發耐藥性的點突變。因此，需要對TKI治療效果不佳的患者篩查BCR-ABL1基因。研究表明，SMRT測序能夠檢測到低至1%的TKI耐藥突變。

　　在傳染病方面，SMRT測序已經被用于流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒的分析。HCV和HIV是長度約為9 kb的RNA分子，HBV是大小為3 kb的環狀DNA病毒，都很適合SMRT測序。除了確定感染病毒的基因組序列，測序還能監控因藥物治療而引起的突變。

　　作者認為，從經濟上考慮，全基因組和轉錄組測序目前只適合科研，但在不久的將來，PacBio系統將成為診斷的選擇。關于Iso-Seq方法，“隨著成本的下降和產量的增加，無偏向的PacBio表達和異構體檢測將在不久后變得常規，”他們寫道。

　　作者在最后總結道，SMRT測序因容易出錯而不適合診斷的說法已經過時，如今的證據表明它相對短讀長測序而言另有優勢。正如第二代平臺超越Sanger測序并掀起基因組醫學的革命一樣，第三代的單分子測序平臺有望掀起下一場遺傳診斷的革命。