RNA的制備(mRNA的分離和RNA酶活性的控制)2

（一）實驗程序
如不謹慎操作，外源性RNA酶可以通過下述途徑污染RNA制品：
（１）玻璃制品、塑料制品和電泳槽 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA〈, /SPAN〉酶，可以不經預處理直接用于制備和貯存RNA。實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經常有RNA酶法染，使用前必須于180℃干烤８小時或更長時間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強烈抑制劑，但其作用并不是絕對的。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小時，然后用滅菌水淋洗數次， 并于100℃干烤15分鐘。在 15 lbf/in2(1.034x105Pa)高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。

羧甲基化的RNA在無細胞體系中翻譯效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤堿基均被修飾，否則其形成DNA：RNA或RNA：RNA雜交休的能力并不明顯降低。用于RNA電泳的電泳槽應用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3％的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 ％DEPC 處理過的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標記，存放在指定地點，為RNA實驗專用。
（２）研究人員造成的污染 RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準備分離的和分析RNA的材料和溶液時，主有涉及RNA的一切操作過程中，都應戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進行RNA實驗時應勤換手套。
（３）污染的溶液 用高壓滅菌的水和RNA 研究專用的化學試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿。可能的話溶液均應用0.1％DEPC于37℃至少處理12小時，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。注：DEPC可與胺類迅速發生化學反應，因些不能用來處理含有Tris 一類的緩沖液。可存幾瓶新的未開封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。

（二）RNA酶的抑制劑
下面介紹３種廣泛應用的特異性RNA酶抑制劑。
（１）RNA酶的蛋白質抑制劑是 從人胎盤分離的一種蛋白質可與多種RNA酶緊密結合（KI≈3x1010）形成非共價結合的等摩爾復合物，使RNA酶失活。此蛋白質體內可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結構與胰RNA酶類似的一種血管生成因子， 幾個廠家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。抑制劑制品凍融數次后或放置在氧化條件下即應棄之不用，因為上述處理會使蛋白質變性從而釋放出所結合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動物細胞這一提取RNA的初始步聚中不應使用這種蛋白抑制劑。然而職用更溫和的裂解方法時應使用這種抑制劑，并且在后續的所有RNA純化步驟中均應有此蛋白質存在。由于酚抽提可以除蛋白質抑制劑，故應在純化過程中補加幾次抑制劑。其最大活性的發揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯。
（２）氧釩核糖核苷復合物 這種由氧釩（1V）離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復合物，是量種過渡態類似物，它能與多種 RNA酶結合并幾科能百分之百地抑制RNA酶的活性。這４種氧釩核糖核苷復合物可加入完整細胞中，在RNA提取和純化的所有過程中，其使用濃度都是 10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細胞中進行翻譯， 并能作為某些外酶促反應（如mRNA反轉錄）的模板。然而氧釩核糖核苷復合物強烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1％羥基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷復合物。
（３）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就發現它能吸附RNA酶，用緩沖液將其制成漿液，以0.015％（W/V）的終濃度溶解細胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續的RNA純化過程中（如酚抽提后）經離心去除。

(三) 破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法
用強烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質， 導致細胞結構破碎，核蛋白由于其二級結構的破壞而從核酸上解離下來。RNA酶可耐受多種處理等，因此可聯用上述試劑，從組織中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整無損的RNA。下述實驗程序系列利用 RNA酶抑制劑和（或）能迅速滅活RNA酶的有關方法從組織或細胞培養物中分離總RNA、核內RNA和胞質內RNA。
這一從培養的單層哺乳動物細胞中分離RNA的實驗程序系為Favaloro 等（1980）所介紹程序的改良。該程序同樣適用于從懸浮培養的哺乳動物細胞中或從易于分散成單個細胞的哺乳動物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA，因為用這種裂解細胞的方法（在SDS存在的條件下用蛋白酶K 消化）去消化組織速度很慢，導致內源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制劑滅活前有時間發揮作用。原方案中（Favaloro等。1980）采用的裂解緩沖液含有0.015 ％（W/V）的Macaloid（硅藻土），用于吸附并滅活RNA酶。盡管現仍有Macaloid出售 NL Chemicals)， 但氧釩核糖核苷復合物和RNA酶的蛋白質抑制劑更常用。下述程序的優點是速度快，并能同時處理很多樣品。