| 實驗步驟 |
一、材料與設備
1. 轉錄緩沖液：200 mmol/I Tris-HCl ( pH 7.5 )，30 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 亞精胺，0.5%（m/V）BSA。
2. 人胎盤核糖核酸酶抑制劑（human placental ribonuclease inhibitor, HPRT) : 20 U/μl。
3. 2 mmol/L DTT : 新鮮配制，過濾除菌。
4. 線狀 DNA 模板：通常 0.5~1 μg/μl。
5. SP6，T7 或 T3RNA 聚合酶。
6. 核苷酸溶液：1.25 mmol/L ATP、1.25 mmol/L GTP、1.25 mmol/L CTP、0.312 mmol/L UTP、0. 312 mmol/L 熒光素-11-UTP 溶于滅菌水。
7. 無 RNase 的 DNaseⅠ：用滅菌水新鮮配制，稀釋至 10 U/ 80 μl。
8. 4 mol/L NaHCO3，高壓滅菌。
9. 6 mol/L NaHCO3，高壓滅菌。
10. 冰乙酸。
11. 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2）高壓滅菌。
12. 10 mg/ml 酵母 tRNA。
13.
雜交緩沖液：可用標準雜交緩沖液。這里推薦一種優化緩沖液成品，可從 Amersham 公句購得。緩沖液由以下成分組成： 4XSSC，600
μg/ml 鮭魚精 DNA，2X Denhardt
溶液。此雜交緩沖液還含有一種用于提高雜交效率的ZL化合物。在使用前，這一緩沖液需用去離子甲酰胺按 1：1 稀釋，稀釋后的溶液可儲存于 -20℃。
14. 20X SSC 儲存液：3 mol/L NaCl，0.3mol/L 檸檬酸鈉（pH7.0 )。
15. 10% (m/V) SDS。
16. TBS：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 )，400 mmoI/L NaCl。
17. 封閉緩沖液：0.5%（m/V）封閉劑（RPN3023、Amersham International），溶于 TBS。
18. 抗熒光素-堿性磷酸醋酶結合物：可從 Amersham 公司購得。
19. 檢測緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl ( pH 9.5)，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2。
20. NBT 溶液：50 mg/ml 硝基藍四唑（niroblue tetrazolium，NBT）溶于二甲基甲酰胺。
21. BCIP 溶液：75 mg/ml 溴-氯-吲哚磷酸（bromo-chloro-indolyl phosphate，BCIP ) 溶于 70% ( V/V ) 二甲基甲酰胺。
二、操作方法
1. 探針標記
(1) 室溫下于 1.5 ml 微量離心管中依次加入下列試劑：轉錄緩沖液 4 μl，0.2 mg/L DTT 1 μl，HPRI 20 U，核苷酸溶液 8 μl，線狀 DNA 模板 1 μg，RNA 聚合酶 25 U，加水至終體積為 20 μl，輕輕混勻。
(2) 至少保溫 2 h。不同的 RNA 聚合酶的保溫溫度不同，SP6 為 40℃，T3 和 T7 均為 37℃。
(3) 標記的 RNA 探針可儲存于 -20℃。
2. 標記探針的純化及加工
(1) 于 RNA 探針混合液中加入 10 U 無 RNase 的 DNase Ⅰ，37℃ 保溫 10 min。
(2) 加入 20 μl 0.4 mol/L NaHCO3，20 μl 0.6mol/L Na2CO3，60 μl 滅菌水。輕輕混勻，于 60℃ 保溫進行堿水解。保溫時間依轉錄物的長度及所需探針的大小而定。
(3) 加入 1.3 μl 冰乙酸，20 μl 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2 )，2 μl 10 mg/ml 酵母 tRNA，500 μl 乙醇，于 -20℃ 至少放置 2 h 以沉淀 RNA。
(4) 于微型離心機上用最高速度離心 15 min 沉淀 RNA，棄上清液。
(5) 用 70% 乙醇淋洗沉淀，保持 -20℃：離心 5 min，棄上清液。
(6) 用滅菌水溶解 RNA 探針，并調整 RNA 探針濃度為雜交所需濃度的 10~20 倍，于 -20℃ 保存。
3. 組織及細胞的預處理
用于原位雜交的所有組織可用中性緩沖的甲醛（4%) 固定，醛固定劑能很好的保留細胞 RNA，甲醛灌注動物或剛冰凍的組織切片應固定于室溫下的甲醛中，未灌流的組織比灌流的組織更易于進行冰凍切片，更易于附著于載玻片上。
(1) 灌流的組織。
用普通鹽水灌流動物以去除血紅細胞，接著用約 200 ml 溶于 0.1 mol/L PBS 中的 4% 甲醛溶液灌洗動物，置于 20% 蔗糖 (溶于 PBS) 溶液中過夜。將組織冰凍于液氮中并儲存于 -80℃。
在約 -20°C 將組織進行切片（10 μm 或更薄 ) 并將切片轉移至經聚賴氨酸處理的載玻片上。于 -80℃ 儲存組織切片。
(2) 未灌流的組織。
將新鮮組織凍干于液氮中或凍干保存于冷卻至 -30°C 的異戊烷中。將組織進行切片并轉至經聚賴氨酸處理的載玻片上。于 -80℃ 儲存組織切片。
雜交前從 -80℃ 取出載玻片并于室溫下直接置于 4% 甲醛中 1 h。用 PBS 或 2X SSC 徹底洗滌。
對于任何
ISH
實驗，為取得成功的結果，此步最為重要。每一個雜交系統，均需要它自己的最佳預處理方案。預處理的設計根據這樣一個原則：既能使探針與抗體的結合物便于接觸到靶分子，又能使組織保持原有的形態結構，并使靶分于保持它原有的位置。另
外，預處理方案還可用于設置 ISH 所必需的一些對照實驗。
4. 雜交和洗滌
雜交嚴格件的控制可通過雜交步驟屮的溫度、鹽濃度和平酰胺的濃度來控制。但是更方便的控制是將這些參數應用到雜交后的嚴格洗滌上。
(1) 雜交緩沖液于 37℃ 預熱 15 min，按 1：1 比例用去離子甲酰胺稀釋，充分混勻。
(2) 于雜交緩沖液中加入所需量經 55℃ 預熱的探針。300~600 ng/ml 的探針濃度適用于大多數雜交。
(3) 用適當體積的雜交緩沖液/探針混合物覆蓋切片。
(4) 將切片放在的電熱板上，放置 3~6 min。保溫時間取決于靶的類型。
(5) 置切片于濕盒中，按所需溫度（典型的是 55℃ ) 及時間進行雜交。
(6) 按所需的嚴格程度洗滌玻片。典型的洗滌程序包括：1X SSC-0.1%(V/V) SDS 于室溫洗兩次，每次 5 min；0.2X SSC-0.1%(V/V) SDS 于 55°C 洗兩次，每次 10 min。
(7)
為降低本底，可用 RNase 對 RNA 探針進一步處理。此步僅僅除去未雜交的單鏈探針。具體步驟如下：玻片于 2X SSC 中淋洗 2 min
后，于預熱的 2X SSC 液（含 RNase A 10 μg/ml ) 37℃ 保溫 20~30 min。在進行下一步驟之前，于 2X
SSC 中淋洗玻片。
5. 封閉、抗體保溫和洗滌
在以下一系列保溫中均需輕輕晃動玻片，除非特別聲明，否則均于室溫下進行。注意：此處所用的 TBS 比標準 TBS 所含的鹽濃度更高。
(1) 玻片于 TBS 中洗 5 min。
(2) 置玻片于封閉溶液中保溫 1 h。
(3) 于 TBS 中淋洗玻片 1min，瀝干玻片上的緩沖液，如有必要，吸干每張玻片表面切片周圍的液體。
(4) 按 1：10000 比例，用含 0.5%( m/V ) BSA 組分 V 的 TBS 稀釋抗熒光素堿性磷酸酯酶結合物。用抗體覆蓋薄片（每張玻片通常用 100 μl），靜置保溫 1 h。
(5) 玻片于 TBS 中洗 3 次，每次 5 min。
6. 檢測
(1) 玻片于檢測緩沖液中洗 5 min，瀝干每一張玻片上的液體，如有必要，吸干玻片表面切片周圍的液體。
(2) 取 45 μl NBT 儲存液和 35 μl BCIP 儲存液加至 10 ml 檢測緩沖液中。每張切片加 500 μl 檢測試劑，置于暗處顯色 4~24 h。
(3) 用蒸餾水淋洗玻片兩次，每次 2 min。
(4) 如需要，進行復染。加上封片劑，并蓋上蓋玻片。
(5) 于光學顯微鏡下觀察結果。
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