RNA大量轉錄合成

實驗材料 模板 DNA 或質粒

試劑、試劑盒 TE TE 飽和酚 氯仿異內醇 3mol LNaAc 無水乙醇 5X 轉錄緩沖液 lOOmmoL LDTT RNasin rATPrGTPrUTPrCTP SF6T3 或 T7RNA 聚合酶 異戊醇 DNase 7.5mol L 乙酸銨 無水乙醇 乙醇

實驗步驟

一材料與設備

1) 模板 DNA 或質粒

2)TE

3)TE 飽和酚：氯仿

4) 氯仿：異內醇 (24:1)

5)3mol/LNaAc(pH5.2)

6) 無水乙醇

7)5X 轉錄緩沖液：200 mmol/LTris-HCl(pH7.9),30 mmol/LMgCl2，10 mmol/L 亞精胺,50 mmol/LNaCl

8)lOOmmoL/LDTT

9)RNasin

10)rATP，rGTP,rUTP,rCTP，各 2.5 mmoI/L

11)SF6,T3 或 T7RNA 聚合酶

12)TE-飽和的酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1,PH4.5)

13)DNase

14)7.5mol/L 乙酸銨

15) 無水乙醇

16)70% 乙醇

二操作方法

1) 在室溫條件下按順序加入以下組分：

5X 轉錄緩沖液                                                      2ul

DTT，100 mmol/L                                                10ul

RNasin100U

rATP,rGTPT,rCTP,rUTP(各 2.5 mmol/L)                   20ul

線狀模板 DNA(1?2.5 mg/ml)                                2ul

SP6,T3 或 T7RNA 聚合酶                                     40U

加無 RNA 酶的水至終體積為                                l00ul

2) 于 37?40℃ 反應 1 h

3) 按 RNA 標準轉錄反應所述的方法除去 DNA 模, 純化 RNA 轉錄物。