Real Time PCR(qPCR)，即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，是一種利用熒光染劑檢測每次PCR循環后產物總量的方法技術，是常規PCR的衍生反應。主要是通過熒光信號的變化實時監測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過ct值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析。因其具有靈敏、特異、精確以及使用簡便等優點，現已發展成為分子生物學研究中的重要工具。

常用術語

首先先定義幾個術語先以確保澄清事實。

基本概念

1.1 實時定量PCR的簡寫

建議實時定量PCR (quantitative real-time PCR) 應當簡寫為qPCR，反轉錄PCR (reverse transcription–qPCR) 應當簡寫為RT-qPCR。用RT-PCR簡寫表示qPCR可以引起混亂，并且與傳統RT-PCR的平常應用不符。

1.2 內參基因

內參基因應當指的是參照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。

1.3 TaqMan探針

TaqMan探針應指的是水解探針(hydrolysis probes)。

1.4 FRET probe

FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉移探針)指的是一種機制，基于2個熒光基團的電子激發狀態之間的相互作用的基礎上的發光/淬火。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。

1.5 定量 quantification

牛津英語詞典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰當的。

1.6 Cq

現在文獻中使用的閾值循環(threshold cycle, Ct)，交點(crossing point, Cp)和分支點(take-off point, TOP) 與PCR反應周期中的術語不一致。這些術語指的實際上在實時儀器是相同的值，只是不同儀器廠家為了競爭給自己產品的特定定義，不具有準確性和清晰性。根據實時定量PCR的標記語言的數據標準(www.rdml.org)，建議同一使用定量循環(quantification cycle, Cq)這個術語。

1.7 基線（baseline）

一般默認為3~15個循環的信號值就是基線（baseline），是由測量的偶然誤差引起的。

基線

1.8 閾值（threshold）

指在擴增曲線的指數增長區域內的適當位置上設定的熒光檢出界限，一般是基線的標準偏差的 10 倍。

閾值

常見問題及解決方案

1.重復性很差

造成qPCR實驗重復性差的原因有以下幾點：

① 移液槍不準，加樣不準確

這種情況下，我們可以更換性能更好的移液槍，擴大反應體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應體系中

② 定量PCR儀在不同位置溫度不一樣

這個需要定期校準定量PCR儀

③ qPCR預混液未混合均勻

使用前應充分混勻qPCR預混液

注：重復性較為理想的擴增曲線STD<0.2

2.熔解曲線為非單一峰

這個可能的原因有以下幾點：

① 非特異性擴增

可以根據設計原則設計新的引物，可通過梯度 PCR 對引物退火溫度進行優化

② 出現引物二聚體，引物為非特異性引物

引物設計不合理導致的引物二聚體在熔解曲線內峰值一般位于75℃左右，如該峰顯著請按照以下方面進行優化：

（A）優化擴增條件，可設置梯度Tm，摸索最佳的Tm值

（B）引物濃度太高，適當降低引物濃度

（C）可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體

③ 模板有基因組污染

重新制備cDNA模板即可

3.Ct值出現過晚

① PCR產物太長

PCR產物不宜太長，一般100-50bp即可

② cDNA模板降解

重新制備模板，重復實驗

③ 擴增效率極低

優化反應條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設計引物

④ 反應體系中存在PCR反應抑制劑

加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重復實驗

⑤ cDNA模板濃度低

減少稀釋度重復實驗

4.內參基因Ct值正常，目的基因Ct值出現較晚

內參基因Ct值正常，說明試劑及操作步驟無誤。目的基因Ct值出現較晚，可能原因為：

① 目的基因表達量偏低--重新富集RNA

② 目的基因引物擴增效率低：

將模板進行梯度稀釋，以確定引物的擴增效率

降低退火溫度

重新設計引物

5.擴增曲線異常，如“S”型曲線

1）反應體系引起的擴增曲線不光滑---擴增效率偏差（過高或過低）

A. 擴增效率過高

出現非特異擴增或引物二聚體：反應體系內模板濃度太高以及模板核酸質量較差可能導致出現抑制PCR反應的現象。在絕對定量時表現擴增效率大于110%。

解決方案：

① 去除模板濃度最高的反應孔并重新分析標準曲線。如果效率重新回到110%以下，則分析良好；

② 對目的基因做標準曲線，一般用克隆該基因的質粒做梯度稀釋，或用PCR 產物做梯度稀釋，然后做定量擴增，通過曲線評估反應效率。絕對定量有效的擴增效率在90%-110%;

③ 重新純化模板，去除模板中存在的潛在抑制物。切記應延長干燥時間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的純化柱加入洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。

B. 擴增效率過低

主要表現在試劑濃度不適（主要是引物、鎂離子和Taq DNA聚合酶），尤其是在多重實驗中，引物對Tm差異超過5°C 以及熱循環條件不合適的情況下，試管中各種同源物質的競爭作用可造成反應效率低下。絕對定量表現：擴增效率＜90%。

解決方案：對上述因素逐一排除后進行調整優化實驗體系。

C. 個別擴增曲線異常

如個別擴增曲線突然驟降：反應管內留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。

解決方案：進行擴增反應之前要仔細檢查反應管內是否有氣泡殘留。

2）儀器設置不當引起的曲線異常

基線設置不當，如擴增曲線斷裂或下滑（基線的終點值大于Ct 值）。減小基線終點(Ct 值- 4)，重新分析數據;

A.基線范圍和閾值設置不當

基線范圍和閾值都是人為設定的參數。二者一般由儀器自動默認為合適值。在對同一程序中的多種試劑盒或化學劑進行評估時，經常出現閾值設置不當造成不同組別數據的擴增曲線差異：軟件自動選擇的閾值更適合平臺更高的曲線，這將導致數據組中的Ct值出現偏差，因為其最佳閾值比此值更低。因此，需對每個數據組進行獨立研究，這樣才能根據具體情形選擇最佳閾值;

B.Rox 添加不當

表現為擴增曲線呈鋸齒狀且不連續，需校正參比染料。

6.絕對定量時標準曲線線性關系不佳

① 加樣誤差

加大模板稀釋倍數，提高加樣體積

② 標準品降解

重新制備標準品，重復實驗

③ 模板濃度太高

增加模板稀釋倍數

7.絕對定量中通過以下參數對qPCR結果加以判定

A.相關系數（R2）：＞0.98，越接近1，結果可信度越高。R＞0.99 或R2＞0.98；

B.標準曲線斜率：-3— -3.5，100%擴增效率對應的斜率是-3.32；

C. PCR 擴增效率（E）：90%-110%，越接近1，越理想。其對應的斜率為-3.58 至-3.10。效率= 10(-1/斜率)-1；

D.檢測靈敏度確認：35Cycles 內可得到好的定量結果，如果采用SYBR 檢測方法，30cycles 內無非特異性產物擴增；

E. NO template control （NTC）確認：35cycles 內無引物二聚體產生；

F. 重復性:STD＜0.2。