SDS堿裂解法制備質粒DNA

堿裂解液 抗生素 乙酵 酚 氯仿 STE TE

LB、YT 或 Terrific 培養液

一、材料

1. 緩沖液和溶液

(1) 堿裂解液Ⅰ

50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。

溶液Ⅰ一次可配制 100 ml，在 15 psi（1.05 kg/cm²）壓力下蒸汽滅菌 15 min，保存于 4℃。

(2) 堿裂解液Ⅱ

0.2 N NaOH（從 10 N 貯存液中現用現稀釋）；1%（m/V）SDS。

溶液Ⅱ要現用現配，室溫下使用。

(3) 堿裂解液Ⅲ

5 mol/L 乙酸鉀 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H₂O 28.5 ml。

所配成的溶液中鉀的濃度為 3 mol/L，乙酸根的濃度為 5 mol/L。保存于 4℃，用時置于冰浴中。

(4) 用于篩選質粒的抗生素

(5) 乙酵

(6) 酚：氯仿（1:1, V/V)

(7) STE

(8) TE ( pH 8.0 ) ：含 20 μg/ml RNase A

2. 培養基

LB、YT 或 Terrific 培養液。

二、方法

1. 細胞的制備

(1) 挑轉化后的單菌落，接種到 2 ml 含有適當抗生素的豐富培養基中（LB、YT 或 Terrific 培養液 )，于 37℃ 劇烈振搖下培養過夜。

為了確保培養物通氣良好：試管的體積應該至少比細菌培養物的體積大 4 倍；試管不宜蓋緊；培養物應在劇烈振搖下培養。

(2) 將 1.5 ml 培養物倒入微量離心管，用微量離心機于 4℃ 以最大轉速離心 30 s，將剩余的培養物貯存于 4℃。

(3) 離心結束，盡可能吸干培養液。

除去上清的簡便方法是用一次性吸管或巴斯德吸管與一個真空管道和一個側臂燒瓶相連。輕微抽吸，并使吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，以盡量避免沉淀被吸到側臂燒瓶中去。也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培養液，并用吸頭除去管壁上附著的液滴。



未從細菌沉淀中除去所有培養液的后果是質粒不能被限制酶切割或不能完全切割。這是因為培養液中的細胞壁成分抑制多種限制酶的活性。這個問題可這樣解決：用冰預冷的 STE ( 菌液體積的 0.25 倍）重懸細菌沉淀并離心。

2. 細胞的裂解

(1) 將細菌沉淀重懸于 100 μl 冰預冷的裂解液液Ⅰ中，劇烈振蕩。

為確保細菌沉淀在堿裂解液Ⅰ中完全分散，將兩個微量離心管的管底互相接觸同時渦旋振蕩，可以提高細菌沉淀重懸的速度和效率。

(2) 加 200 μl 新配制的堿裂解液Ⅱ于每管細菌懸液中，蓋緊管口，快速顛倒離心管 5 次，以混合內容物，切勿振蕩！將離心管放置于冰上。

應確保離心管的整個內壁均與堿裂解液Ⅱ接觸。

(3) 加 150 μl 用冰預冷的堿裂解液Ⅲ，蓋緊管口，反復顛倒數次，使溶液Ⅱ在黏稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上 3~5 min。

(4) 用小離心機于 4℃ 以最大轉速離心 5 min，將上清轉移到另一離心管中。

(5) （選用）加等量體積的酚：氯仿，振蕩混合有機相和水相，然后用小離心機于 4℃ 以最大速度離心 2 min。將上清轉移到另一離心管中。

有些研究者認為不必用酚：氯仿抽提。然而，這一步驟的省略可能會導致獲得不能被限制酶切割的 DNA。用氯仿抽提的目的是從水相中除去殘余的酚。酚在水中微溶，但能被氯仿抽提到有機相中。幾年前在一些實驗室中，通常用聞氣味的方法檢査 DNA 制品中殘留的酚。該方法不宜提倡。

3. 質粒 DNA 的回收

(1) 用 2 倍體積的乙醇于室溫沉淀核酸，振蕩混合，于室溫放置 2 min。

(2) 用微量離心機于 4℃ 以最大轉速離心 5 min，收集沉淀的梭酸。

最好養成總是用同一種方式在離心機中放置離心管的習慣，例如，按順序放置，將離心管的塑料柄朝外。沉淀總是在離轉頭中心最遠的離心管內壁聚集。知道 DNA 沉淀在什么地方可以較容易地找到可見的沉淀，也就能有效地溶解看不見的沉淀，在離心管的側面及頂部都做好標記，這樣即使字跡棋糊了也能辨識各管。

(3) 按上述步驟 3 所述小心吸去上清液，將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體流出排干，用 Khnwipe 或一次性吸頭除去管壁上的液滴。

(4) 加 1 ml 70% 乙醇于沉淀中并將蓋緊的試管顛倒數次，用微量離心機在 4℃ 以最大轉速離心 2 min，回收 DNA。

(5) 再次用步驟 3 所述的方法輕微抽吸除去所有的上清。

(6) 除去管壁上的酒精液滴，將開口的試管應置于室溫使酒精揮發，直至試管內沒有可見的液體存在（5~10 min)。

如果用干煤器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情況下它會變得難以溶解并且可能變性（Svaren et al. 1987）。將沉淀在室溫下干燥 10~15 min 對于乙醇揮發來說足夠了，而且不會引起 DNA 脫水。

(6) 用 50 μl 含有去 DNA 酶的 RNA 酶 A ( 胰 RNA 酶）（20 μg/ml）的 TE 重新溶解核酸，溫和振蕩幾秒鐘，貯存于 -20℃。