Southernblot檢測技術在模式動物制備中的應用?（二）

圖4. Southern blot鑒定同源重組事件^[4]

另外，在制備基因敲進和條件性基因敲除模式小鼠過程中，Southern blot檢測是非常重要的一步。在我們以往的工作中，其中一例Cre定點敲進課題（如圖5），Southern blot檢測結果顯示：小鼠1號，有明顯的隨機插入現象。

圖5. Southern blot 檢測定點敲進

Southern blot檢測技術雖不是萬能的，但絕對是金標準！

也有人會說：既然是隨機插入，很可能插入在不同染色體，理論上就完全可以通過后續交配稀釋或去除，那再多交配一代是不是就可以稀釋甚至去除隨機插入呢？

讓我們看看事實是怎樣的：依據我們大量的數據統計分析發現，采用ES細胞方式制備，大約有20%的概率有隨機插入，由于ES細胞法制備中可以在細胞這一步就進行Southern鑒定，進入下一批小鼠制備的ES細胞可以確保為Southern陽性；而采用CRISPR/Cas9技術，隨機插入的概率約32%，不同的是用CRISPR/Cas9就直接得到了小鼠，只能在小鼠水平篩除隨機插入。而這32%中有14%的隨機插入是無法靠交配傳代去除的（見圖6）。是否“隨機插入”不是真的“隨機”的呢？是不是像轉基因一樣，更多的情況是打靶載體或插入序列，會容易在目的插入位點插入多個拷貝，造成同一染色體/同一位點的多拷貝“隨機”插入呢？^[8] 我們沒有詳細做過調研，但是接近一半可分離的隨機插入比例，預示了有這種可能。而此時，只能通過Southern blot對基因組DNA特定序列定位，進而排除隨機插入的風險。^[5-6]

因此，Southern blot雖然有它自己的限制，如費用高，片段有技術極限等，但仍然是模式動物制備檢測隨機插入的金標準！

圖6. 隨機插入的概率分析^[5]

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

[2] Nelson, D.L, Cox, M.M.Lehningers?Principles of Biochemistry, 5th edition. 2008

[3] Sommer D, et al.Efficient genome engineering by targeted homologous recombination in mouse embryos using transcription activator-like effector nucleases. Nat Commun.2014;5:3045.

[4] http://ko.cwru.edu/info/targvect design.html

[5] http://www.sohu.com/a/24558079 3_227596

[6] http://www.bbctg.com.cn/index/index/knowledge/id/52.html

[7] https://baike.baidu.com/item/southern blot

[8] Ng P, et al. The Molecular Basis of Multiple Vector Insertion by Gene Targeting in Mammalian Cells. Genetics.1999 Mar;151(3):1143-55.