Southernblot實驗

具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則特異性地雜交形成雙鏈。利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制性內切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。

Southern印跡雜交技術包括兩個主要過程：一是將待測定核酸分子通過一定的方法轉移并結合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與同位素標記的探針在一定的溫度和離子強度下退火，即分子雜交過程。

基因組DNA PCR產物

EcoR l 反應buffer TBE DNA landing buffer 變性液 SSC轉移液 Washing buffer detection buffer maleic acid buffer

eppendorf 管 Tip頭 PCR儀 無粉手套 水平電泳儀 轉移槽 尼龍膜 吸水紙及濾紙

1.  基因組DNA限制性內切酶酶切

（1）設置50 ul 反應體系，在200 ul EP管中加入：
 

10 ug 基因組DNA x ul 去離子水 49-x ul 10×buffer 5 ul EcoR Ⅰ 4 ul
 

（2）充分混勻，離心20 s。

（3）置于PCR議上37℃反應過夜。

（4）加1/10體積乙酸鈉、2體積無水乙醇沉淀DNA晾干。

（5）加20 ul TE buffer溶解DNA。

2.  DNA瓊脂糖凝膠電泳

（1）用0.5xTBE buffer配制0.8%瓊脂糖凝膠，微波爐加熱至溶化，加入EB（0.5 ug/ml）混勻后倒入制膠器中室溫凝固。

（2）凝固后，去除樣品梳及膠帶，置于水平電泳儀中。

（3）將DNA樣品用6xDNA landing buffer 混勻后加入樣品孔中，恒壓電泳（20 V/10 mA）直至染料電泳至邊緣。

（4）電泳完畢，取出凝膠切角并在凝膠成像系統成像記錄。

3.  DNA轉移與固定

（1）凝膠置于0.25 M HCl中處理30 min，去離子水洗1次。

（2）堿變性：凝膠置于0.4 M NaOH變性液中作用20 min。

（3）毛細管法轉移：根據凝膠大小裁剪與其等大小尼龍膜、濾紙片，尼龍膜一角軟鉛筆作方位標記。

（4）去離子水浸泡尼龍膜、濾紙片，中再浸泡5 min。

（5）按下圖安裝轉移槽進行轉移過夜（0.4 M NaOH轉移液）。

（6）轉移完畢后取出尼龍膜，2xSSC浸泡5 min，濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙。
 

4.  預雜交與雜交

（1）預雜交：將尼龍膜置于預熱DIG Easy Hyb工作液（37℃~42℃）中搖晃充分作用30 min。

（2）探針變性：DIG標記探針煮沸5 min 后迅速置于碎冰中，用預熱DIG Easy Hyb工作液制備含探針的雜交液。

（3）棄去預雜交液，加入雜交液42℃搖動孵育4小時或過夜。

（4）2xSSC（in 0.%SDS）洗膜2次（5 minx2），不斷搖動。

（5）5xSSC（in 0.%SDS）洗膜2次（155 minx2，65~68℃），期間不斷搖動。

5.  雜交檢測

（1）Washing buffer潤洗1遍（3~5 min）。

（2）100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。

（3）100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。

（4）Washing buffer洗膜（15 minx2）。

（5）20 ml detection buffer 平衡2~5 min。

（6）將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數min至1天（出現顏色時不要搖動）。

（7）當出現條帶時，TE-buffer洗膜（5 minx1），終止現色。

（8）照相記錄，80℃烤干，儲存。

（9）掃描計算EGFR基因擴增的倍數。

1. 為了防止緩沖液流從凝膠邊緣之外通過，沿凝膠的每一邊放置一條 Parafilm膜，使濾紙橋與層疊上部的吸濕材料無法接觸。 

2. 核酸轉移的選擇尼龍膜比NC膜好，是目前較理想的核酸固相支持膜。

3. 尼龍膜漂洗盡量徹底，可降低背景。

4. color-substrate solution要新鮮配制。

影響雜交的因素：

1.待檢核酸分子的濃度和長度

（1）濃度越大，復性速度越快，敏感性越高；

（2）分子越大，轉膜越困難，敏感性越低；

（3）轉膜方法

2.探針的性質（標記效率、濃度，核酸性質）

（1）對于單鏈探針，濃度越高，雜交率增加；

（2）探針標記方法和檢測方法的選擇；

3.雜交液體積、溫度和雜交時間

（1）體積越小，雜交動力學越高；

（2）DNA/DNA雜交適宜的復性溫度為比Tm低20——25℃；

（3）溫度越低，非特異性越高；溫度越高，敏感性越低；

4.雜交液的離子強度

（1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（Na+的作用）；

（2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩定，當進行序列不完全同源的雜交時，必須維持雜交液與洗膜液中較高的鹽濃度；

5.非特異性雜交反應

雜交前封閉膜上非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異吸附。

6.雜交后的漂洗

鹽濃度、溫度、次數、體積

7.固相膜的選擇