T淋巴細胞轉化實驗

淋巴細胞轉化試驗有形態計數法、MTT 法和同位素法三種。
 

MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法。MTT 是一種噻唑鹽，化學名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。小鼠脾細胞受到ConA 作用后發生增殖活化，其胞內線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應升高，MTT 作為其底物參與反應，形成藍色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細胞內或細胞周圍，經鹽酸─異丙醇溶解后為藍色溶液，可用酶標測定儀測定細胞培養物的OD 值，測定波長570 nm。根據OD 值的大小計算反應體系中細胞增殖程度。

³H-TdR 摻入法：細胞增殖的基本條件或前提為細胞質和細胞核的復制，這是正常細胞增殖過程缺一不可的前提。一般來說，一個細胞周期可大致分為四期，即G1 期、S期、G2 期和M期。其中S期為DNA合成期，主要功能活動為DNA合成。³H-TdR即（甲基-³H）胸腺嘧啶核苷（[³H-methyl]thymidine），是DNA合成的前體。加入細胞培養液中后被細胞攝取作為DNA合成的原料。細胞合成的DNA越多，則所摻入的³H-TdR就越多，因此，檢測所摻入的³H-TdR就可反映細胞增殖的程度。因該方法有同位素污染問題，故我們實習中仍用MTT法。

ICR小鼠

RPMI1640培養液 Hank's液 刀豆蛋白A MTT 碘酒 酒精

無菌尖吸管 刻度吸量管 無菌解剖器械 平底培養板 CO2培養箱 酶標測定儀

1.  小鼠脾細胞懸液的制備
 

取一個滅菌的平皿，加入5 ml Hank's液。頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，放入平皿中，在鋼網上研磨并過篩，制成細胞懸液。取出100 μl用于計數。將其余細胞懸液移入一離心管中，離心1500 rpm，7 min，（或1000 rpm，10  min）棄去上清，用RPMI1640 培養液稀釋，制成2.5×10⁶ /ml的脾細胞懸液，然后加入ConA使每孔最終濃度為2 μg/ml，同時做不加ConA的陰性對照孔。

2.  將上述細胞懸液加入96孔平底培養板中，每孔0.1 ml。
 

3.  將培養板放入含有5 %CO₂的37 ℃培養箱中培養48-72 小時，在培養結束前4-6 小時，于培養板各孔內加入1 mg/mlMTT液，10 μl/孔。37 ℃培養6 小時。

4.  各孔內加入0.01 M 鹽酸—異丙醇110 μl，30 分鐘內（或加2 %SDS100 ul/孔，過夜）用酶標測定儀測OD 值，測定波長570 nm。

1.  由于本實驗需要培養3 天，才能觀察結果。因此，在操作時應注意無菌操作，避免細菌污染，導致實驗的失敗。
 

2.  細胞操作要輕柔、迅速，以免細胞損傷影響實驗結果。





 

一、實驗結果

將實驗組和對照組三個復孔的 OD 值平均。
 

轉化值=實驗組的平均OD 值-對照組的平均OD 值。