TRlzol試劑一步分離RNA實驗

氯仿 異丙醇   乙醇 無RNase的水 SDS溶液 TRIzol 試劑

一 材料與設備

1)氯仿   

2)異丙醇   

3)75%乙醇（用DEPC水配制）   

4)無RNase的水（將水加入無 RNase 的玻璃瓶內，加濃度為0.1 % ( V /V)的DEPC過夜 ，尚壓滅菌）   

5)0.5%SDS溶液（必須DEPC處理過的高壓滅菌水配制 ）  

6)TRIzol 試劑


二 操作方法

1 . 勻漿

1 ) 組織：每 50?l0 mg組織，加入1ml TRIzol試劑，用玻璃 -Teflcm 或電動勻漿器勾漿。樣本體積不能超過 TRIzol 試劑的10%

2 ) 單層培養細胞：在 3. 5cm  的培養皿中加入 1ml TRIzol 試劑?用吸管抽吸細胞多次，直接裂解細胞。加入 TRIzol試劑的量取決于培養皿的大小（1ml / 10cm²）而不取決于細胞的量。TRIZol 試劑的量若不足，分離的 RNA 易受 DNA 污染。

3 ) 懸浮細胞：離心收集細胞，加 入 TRIzol 試劑屮反復吹打裂解細胞。動物,植物,酵母每 5X10⁶～10×10⁶ 個細胞用 lml TRIzol 試劑。加 TRIzol  試劑前請勿洗滌細胞，因為這樣會增加 RNA 的降解。可用勻漿器裂解細蔭和酵母細胞。

2 . 相的分離

1 ) 勻漿后于 15 ?30 ℃放置 5min，以保證核蛋白復合體完全分離。

2 ) 加入 0.2m l 氯仿 /lm l TRIzol試劑。蓋好樣本管于 15 ?30℃ 用手劇烈搖動 15s ，放置 2?3min。于 2?8° C 小于 12000 g 離心 10mm。離心后、混合物分為三相：即最下層紅色的酚-氯仿相，中間相以及上層水相& RNA絕大多數留于水相,水相體積用于勻漿的 TRlzol 試劑體積的 60%。

3. R N A 沉淀

1 ) 將水相移至一新管（若要分離DNA或蛋白質，保留有機相），加人異丙醇，混合均勻，以沉淀 RNA。每1ml TRizol試劑加入0. 5ml 異丙醇，于 15?30℃ 放置 10min

2)于2 ?8℃小于12000 g 離心 10min. 離心前，常看不到 RNA 沉淀，離心后 RNA 形成膠狀顆粒物.沉枳在管的底部和壁上。

4. R N A 洗滌

1 ) 移去上清液，用 75% 乙醇洗滌 RNA 沉淀一次，每 1mlTRIzol 試劑至少加入加入1ml7 5 %  乙醇混勻，于 2?8℃ 7500g  離心5min。

 2 )棄上清

5.RNA溶解

1) RNA沉淀空氣干燥 5?l 0 min。勿在真空狀態下離心干燥RNA，并注意勿使 RNA 完全干燥，因為這會大大降低其溶解性。若RNA 未完全溶解，其  A_260/280 <1.6

2 ) 加入不含 RNase 的水或 0.5% SDS 溶液，反復吹打以溶解RNAg 如RNA較難溶解，可于 55?60℃ 助溶 10min

1)RNA 產量低：其原因可能有以下幾點：樣本未完全勻漿或裂解；RMA 沉淀未完全溶解。

2)A_260/280＜1.65 其原因可能有以下幾點：樣本太少；勻漿后，標本未室溫放置水相受酚污染;RNA 沉淀未完全溶解。

3)RNA 降解：其原因可能有以下幾點：從動物中取出的組織未立即加工或凍存；分離 RNA 的樣本儲存于-5?一 20°C, 而不是一 60?一 70℃：; 細胞被胰酶消化；溶液或管中含有 RNase; 用于瓊脂糖凝膠電泳的甲醛 PH<3.L

4)DNA 污染：其原因可能有以下幾點：樣本太少；用于分離的樣本含有機溶劑如乙醇、DMSO) 雖緩沖液或堿性溶液。

5) 蛋白多糖和多糖的污染：下列改進的 RNA 沉淀法（步驟 3), 可從分離的 RNA 中去除這些污染物。水相中每毫升 TRIzolml 加入 0.25 ml 異丙醇，再加 0.25 ml 卨鹽沉淀液 (0.8mol/L 檸檬酸鈉 1.2mol/LNaCl), 混合，離心，如前所述。這樣可有效沉淀 RNA 而蛋白多糖和多糖則留在液相。

6) 從少量樣本 (細胞≤10⁴ 或組織≤10 mg) 中提取 RMA 時，加入 0.8 mlTRIzol 試劑，勻漿后，加入氯仿，進行 RNA 的分離，如步驟 2。用異丙醇沉淀 RNA 前，加入 5?10 微克無 RNase 的糖原。

7) 若樣本中含有高濃度的蛋白質 J 旨肪. 多糖或細胞外物質，肌肉、脂肪組織、植物莖塊，則需進行額外的分離。勻漿后，2?12000 g 離心 10 mm, 將不溶性物質去除所得的沉淀包含有細胞外膜、多糖和髙分子質量的 DNA，上清液則含有 RNA。來自脂肪組織的樣本，脂肪聚集在上層，可去除. 將處理好的勻漿液移至新管，如上所述，加氯仿進行液相分離.

8）勻漿后加氯仿前樣本可于-60?- 70℃ 儲存至少一個月。RNA 沉淀可在 75% 乙醇中 2?8℃ 放置至少一個星期，- 5?-20 ℃至少放置一年。

9) 若在步驟 2)、3) 中，離心轉速為 2600 g, 時間需增加到 20?30 min。

10)TRIzol 試劑有毒，若與皮膚接觸后，用清洗劑充分水洗。若感覺不適，應速去醫院。TRIzol 試劑儲存于 2?8℃ 若室溫儲存，有效期為 12 個月。