WesternBlot相關技術操作與原理1

【實驗原理】： Western Blot 印跡方法，又稱為免疫印記，是將獲得的蛋白質樣品通

過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質進行分離，并通過轉移電泳將凝膠上分離到的蛋白質轉印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非標記抗體（一抗）與轉印后膜上的靶蛋白進行特異性結合，再與經辣根過氧化物酶標記（偶聯）的二抗結合，最后用ECL超敏發光液試劑檢測。如果轉印膜上含有靶蛋白，經X 光片曝光、 顯影后，則會在X-光片上出現特異性蛋白條帶。

Western blot 實驗分為三個部分：

1． 樣品蛋白質的制備、 蛋白質含量測定 2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

3． 凝膠轉膜及其檢測

以提取細胞蛋白為例Western 印記雜交實驗流程圖：

提取細胞總蛋白、測定含量

↓

制備SDS-PAGE 膠

↓

蛋白樣品變性、電泳

↓

電泳轉膜

↓

封閉

↓

一抗

↓

TBST 洗滌

↓

HRP 標記的二抗

↓

TBST 洗滌

↓

ECL 試劑作用

↓

X-光片曝光、顯影

↓

結果分析

細胞總蛋白的提取及含量測定

一、細胞總蛋白的提取

    提取細胞蛋白多是利用將細胞裂解、破碎、使蛋白質釋放的原理。提取蛋白質的方法很

多。其目的都是要獲取高豐度、高品質的蛋白質,以滿足實驗需要。

    在提取蛋白質實驗中要特別考慮到細胞裂解液的pH、去污劑的類型和濃度以及二價陽

離子、輔助因子等因素，同時為防止細胞內蛋白酶對蛋白質的降解，需在裂解液中加入蛋白

酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的種類很多，如PMSF(苯甲基磺酰氟)；金屬蛋白酶抑制劑乙二胺

四乙酸（EDTA）、乙二醇雙四乙酸（EGTA）；肽蛋白酶抑制劑：亮抑酶肽（leupeptin）、胃蛋白酶抑制劑A（pepstatin A）、抑蛋白酶肽（aprotinin）；甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮（TLCK）、

甲苯磺酰丙氨酰氯甲酮（TPCK）等，要根據具體情況具體選擇。

        制備蛋白質樣品應遵循下述原則：

    1．盡可能采用簡單方法進行樣品處理，以避免蛋白丟失。

    2．細胞和組織樣品的制備應盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以防止蛋

白酶的降解。

    3．樣品裂解液應該新鮮制備，并且分裝凍存于-80℃。切勿反復凍融已制備好的樣品。

（一）試劑

    1．細胞總蛋白裂解緩沖液：

     蛋白抽提試劑盒-I (實體組織和細胞蛋白抽提,)

    2．PMSF 儲存液(100mmol/L)： 稱取PMSF 17.4mg，溶于1ml 異丙醇，分裝后儲存于

-20℃。

注意:

PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不穩定，故應在臨用前再加入到細胞裂解緩沖

液中， 使其終濃度為0.174mg/ml，如：1 ml 細胞裂解液中，加入10ul PMSF 儲存液.

（二） 儀器和耗材 冷凍離心機

無菌的Tip 頭、1.5ml 及0.5ml 離心管 ，

（三） 實驗材料 Hela 細胞

（四） 實驗步驟

1．細胞的預處理：

由37℃ CO2 培養箱中取出于60mm 細胞培養皿中培養的Hela 細胞，（細胞數約為5

×106 ），吸棄原培養液，用4℃預冷的1×PBS 洗細胞表面3～4次，以去除培養基中的血清

及死細胞，并盡量吸棄細胞培養皿中殘余的PBS。將洗滌后細胞直接凍存于-80℃冰箱，待

提取蛋白質。此方法可保存細胞至少兩周。（注：如果需要，當用PBS 洗滌細胞后，不必-80℃冰箱凍存，可直接進行步驟2）

2．（由-80℃冰箱中取出細胞培養皿，將其置于冰上，） 向上述各培養皿中加100ul 含

PMSF 的蛋白提取液，輕輕晃動，使裂解液均勻鋪于細胞表面。

3．冰浴40 分鐘（通常冰浴時間為30～60 min），期間晃動3-4 次培養皿，使其作用均

勻。

4．用Tip 頭集中蛋白提取液，將其收集入冰上預冷的1.5ml Ep 管中，4℃離心，12,000g

× 20min。

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