WIKI資訊
外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞后可被修復。相鄰的５'磷酸和３'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的ＤＮＡ連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶。實際上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶都是首選的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端ＤＮＡ片段連接起來。 ＤＮＡ一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種......閱讀全文
外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜
一、RNA 制備 模板mRNA 的質量直接影響到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的結構特點,容易受RNA 酶的攻擊反應而降解,加上RNA 酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA 酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA 酶,人
目的：了解T4DNA連接酶的幾種生物學功能及用途；學習在T4DNA連接酶的作用下，載體與目的基因的幾種不同的連接方式以及在標準的連接反應體系中，質粒載體和插入的外源DNA的比率關系和各自的用量；掌握用Pmd18-Tvector與PCR產物進行T-A克隆的機理及其應用。原理：外源DNA片段和線狀質粒載
當我們已經獲得目的基因片段，選擇好適當的克隆（或表達，轉化）質粒載體， 并確定重組方案后，下面要進行的就是ＤＮＡ片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 此重組子可轉入相應的宿主菌中用于對目的基因的擴增以及目的基因表達（如現代基因工程藥物的生產），還可用于序列分析和轉基因等重要生物技術的研究中。&nbs
目的基因的亞克隆所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。 亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。&n
所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。 一、試劑準備 1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細
連接反應的策略 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：──────────────────────
第一章質粒DNA 的分離、純化和鑒定 第二章DNA 酶切及凝膠電泳 第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化 第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第五章重組質粒的連接、轉化及篩選 第六章基因組DNA 的提取 第七章RFLP 和RAPD 技術 第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆 第九章分
重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在
實驗概要所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。主要試劑1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可
（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應 外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成
實驗方法原理 亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。
質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA 片段( ＜10kb) 且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質粒轉化細菌，即可完成。但在實際工作中，
實驗概要 體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。實驗原理 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先
實驗方法原理TA克隆 系統由Invitrogen公司（San Diego，CA）發展而來的商業性試劑盒，它用于PCR 產物的克隆 和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR 產物的3'末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3'T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位
目的基因的亞克隆可應用于：（1）進一步分析目的基因；（2）基因重組。實驗方法原理亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。實驗材料E.coli JM109試劑、試劑盒牛肉膏胰蛋白胨NaCl微量細菌基因組抽提試劑盒
連接反應（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應 外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況
（一）重組T質粒的構建一．原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的 DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌
PCR引物決定PCR的特異性，引物的設計就顯得尤為重要。下面以已知DNA序列設計引物為例介紹設計引物應考慮的幾個方面：1、GC比值：眾所周知,堿基對中的GC之間有三條氫鍵，AT之間有兩條氫鍵，GC和AT在引物序列中的合理比例是設定PCR中退火溫度的重要依據。通常在一個引物中GC和AT各半即可。2、長
外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口，當雜本導
10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫蘇糖醇500μg/ml 牛血清白蛋白（組分Ｖ.Sigma產品）（可用可不用）該緩訓液應分裝成小份，貯存于－20℃。另外，再設立兩個對照反應，其中含有（1）只有質粒載體；（
克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。每一重組體中外源 DNA 的連接方向和插入數量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。作為一般規律，如果連接反應中質粒和目的 DNA 摩爾數相等，而且 DNA 的總濃度少于 100 μg/
實驗概要本技術以pBS質粒、E. coli DH5α為例介紹了重組質粒的連接、轉化及篩選。實驗原理本實驗所使用的載體質粒DNA為pBS，轉化受體菌為E.coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因，故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補現象篩選相結合的方法。因pBS帶有Amp
DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發現的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA
材料、設備及試劑 一、 材料 外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知; 載體DNA: T-vector(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。 二、 設備 恒溫搖床，臺式高速離心機，恒
第二節 材料、設備及試劑一、 材料外源DNA 片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA 溶液,濃度已知; 載體DNA : pBS質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。二、 設備恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋
質粒克隆操作最費時間的步驟是用電泳的方法對預期大小的外源 DNA 片段和質粒 DNA 片段進行純化，可以用于將質粒和外源 DNA 的連接在低熔點球脂糖存在的條件下完成實驗方法原理質粒克隆操作最費時間的步驟是用電泳的方法對預期大小的外源 DNA 片段和質粒 DNA 片段進行純化，在以下的方案中（取自S